抗原調製
スケジュール
- 1日前 大腸菌の培養 Step 1、Step 2、LB－Amp培地の作製
- 1日目 大腸菌の培養 Step 3、タンパク精製 Step 1
- 2日目 タンパク精製 Step 2、SDS-PAGE、CBB染色、タンパク定量 (タンパク濃縮)
PBS : 10×stockをmilliQ水で10倍希釈
Buffer A : 50mM Tris-HCl pH 7.4、100mM NaCl
isopropyl-thio-β-D-galactoside(IPTG) 0.2g／ml stock
PMSF/イソプロパノール 10mg/ml stock
Lysozyme
Triton X-100 20% stock
Fusion protein、beadsとelution buffer
GST-fusion protein ＝ Glutathione sepharose
beads
Elution buffer : 10 mM glutathione/25 mM Tris-HCl (pH8.0)/100 mM NaCl
用事調製
MBP-fusion protein ＝ Amylose resin
Elution buffer : 10 mM maltose/25 mM Tris-HCl (pH8.0)/100 mM NaCl
His6-fusion protein = NiNTA-Agarose
Elution buffer : 200 mM imidazole/50 mM Tris-HCl (pH7.4)
前日
大腸菌の培養 Step １
- 培養dishから1コロニーずつ竹串で削り、LB－Amp培地50mlを入れた
100ml culture bottle 3本にinoculateする（無菌操作） - 37℃で夜までincubate
LB－Amp(液体)培地の作製
- 20㍑の攪拌ビーカーをＤＷで洗い、スターリングバーを入れる.
- Bacto tryptone 【10g／1㍑】
Bacto yeast etract【5g／1㍑】
NaCｌ 【5g／1㍑】
ＤＷ
を加えて溶かす. - 2㍑の三角フラスコ(×10)に1350mlずつ分注し、アルミホイルで蓋をし、
オートクレーブ、121℃、20分
大腸菌の培養 Step 2
- 大腸菌をinoculateしたLB－Amp培地を2㍑フラスコに移し、1500mlにする.
- 37℃でincubate、overnight
1日目 a.m.
大腸菌の培養 Step 3
- B培地1350mlが入ったフラスコ10本に培養液を150mlずつ移す
- 37℃でincubate、１時間
- 30℃でincubate、30分
シェーカーの左側のドアを開けて温度を下げる
この間に,IPTG(0.2g/ml) stockを出し、溶かしておく - IPTG(0.2g/ml) stockを200μl/フラスコ加える
- 30℃でincubate、3時間
1日目 p.m.
大腸菌回収
- 培養液を大腸菌用遠心チューブに、7～8分目まで注ぎ込み、
遠心 6000rpm、８分、4℃
No.30のローターを使用 - Supを捨て、残りの培養液を注ぎ、遠心
培養液がなくなるまで繰り返す
時間をみて遠心ローターNo.25(50cc corning tube専用)を4℃に冷やしておく. - Supを捨て、PelletをPBSでresuspendし、
50cc corning tubeに６本程度に分注
各tube大腸菌1.5￣3リットル分のpelletになるようにする - 遠心 5000rpm、15min、4℃
- Supを捨て、大腸菌のPelletを得る
このpelletの状態で-20℃で保存可能
大腸菌の可溶化
- Lysis buffer : 1 mg/ml lysozyme、100 mg/ml PMSF、25 mM Tris-HCl (pH7.4)、100 mm NaCl
- 各50cc corning tubeのpelletをlysis buffer 20￣30mlでresuspend
- vortex mixerで均一になるまでよくvortex
- Sonication 10sec×6.
- 可溶化のため20% Triton X-100をfinal 1%になるようにを加える
- 転倒混和
- 超遠心35000rpm、20min、4℃
超遠心機の取扱いに注意
はじめての人は経験者と一緒にやりましょう - Supを50cc corning tubeに回収し、適切な50% beadsを500μl加え、蓋をパラフィルムでシールする
- 4℃でincubate、overnight
2日目
タンパク精製 Step 2
- 遠心1000rpm、2分、4℃
- Supを取り除く（一応保存しておく）
- beadsを洗いこむ
各50cc corning tubeのPelletにBufferAを40mlを加える - 遠心1000rpm、2分、4℃
ビーズの洗いを４回繰り返す - カラムを準備する.
カラムの詰まりがないことをMilli Qを流して確認後,Bufferで洗う. - BufferA 2mlにresuspendしたビーズをカラムへload
この間に1.5cc tube(10本×2セット)を準備する
SDS-PAGE用のセットには,3×SDS stopping bufferを7μl入れておく - Elution bufferを500μl￣1000μlカラムに入れ、eluate fraction no.1￣10まで
- 各fraction 14μlをSDS-PAGE用のチューブに分け、残りはon ice
カラムは上下に蓋をして残しておく - タンパク定量、SDS-PAGE（定量マーカーBSAを脇に流しておくこと）
- CBB染色
- サンプルは-80℃保存
必要ならば、濃縮する