ノザンブロッティング
Prime-a Gene Labeling System (Promega) を使用
- 大実験室 96℃ブロックincubator ON
- RIセンター 37℃ water bath、42℃ water bath、96℃ブロックincubator ON
1.5cc microtube
ノザン用DNAプローブ 10 ml
↓ 96℃、5 min
↓ on ice
↓ add 20 ml D.W.
↓ add 10 ml 5xreaction buffer
↓ add 2 ml dATP dTTP dGTP mixture
↓ add 2 ml BSA
RIセンターへ
RI B2 小分け室
↓ add 5 ml 32P-dCTP
↓ add 1 ml Klenow enzyme
total 50 ml
RI 実験室へ
37℃ water bath 60min
↓ この間にBIO-RAD BIO-spin30カラムをprespin（1000×g、3分、4℃）つかい回し15 cc corningに受ける
↓ add 50 ml TEN
↓ 全量prespin済BIO-RAD BIO-spin 30カラムへ（新しい15 cc corningに受ける）
↓ 遠心1000×g、3分、4℃
↓ flow through (100μl)
↓ 0.5 cc microtubeに移し、TENを加えてfinal 300 mlにする
300 mlノザン用プローブ完成
ノザン用プローブ1 mlを1mlのmilliQ水を入れた1.5 cc microtubeに入れて、さらにシンチレーションバイアルに入れてcountを測る。
残り299 ml
↓ 96℃、5 min
↓ 新しいノザン用メンブレン（使いまわしの場合はプレハイブリの必要なし）
ノザン用ハイブリbufferを50℃で温めておく
プレハイブリ ノザン用ハイブリbuffer 6 ml 42℃、3-6 hrs
↓ メンブレンをノザン用ハイブリbufferでリンス、湿らせる
↓ 2×106 cpm / mlになるようにノザン用ハイブリbufferを加える
（5 mlはほしいがprobeのcountによる）
メンブレンに直接かからないようにプローブを加える（100 mlずつ3回）
↓ 42℃、shake 45 rpm (大きいタッパーに42℃の湯を入れて小さいタッパーを2個浮かす)
↓ overnight （RIから出るときに記録をつける）
↓
↓ waterbath 50℃に設定する
↓ Rince with wash solution 1
↓ wash solution 2、50℃、30 min
↓ wash solution 2、50℃、30 min
↓ びしょびしょのままラップに包んで台紙に貼ってIP overnight解析する
必要なら、X-ray filmにexpose（-80℃）〜1weekして現像する
ノザン用ハイブリダイゼーションbuffer
| stock | |||
| 5×SSPE | 20×SSPE | 50 ml | |
| 10×Denhardt’s solution | 50×Denhardt’s | 40 ml | |
| 100 μg/ml salmon sperm DNA | 30mg/ml | 0.7 ml | （ボイルして加える） |
| 50% formamide | 100 ml | ||
| 2% SDS | 4 g | ||
| 200 ml |
Wash solution 1
| stock | ||
| 2×SSC | 20×SSC | 20 ml |
| 0.05% SDS | 10% SDS | 1 ml |
| 200 ml |
Wash solution 2
| stock | ||
| 0.1×SSC | 20×SSC | 1 ml |
| 0.1% SDS | 10% SDS | 2 ml |
| 200 ml |