Flow cytometryのための表面抗原染色（FITC, PI）
- Cell
- PBS wash 4 ml x 3 times
- 0.5 mM EDTA / PBSを1 ml加え、RT, 10 min.
- 回収。500 μlのPBSで洗いこむ。
- 2,000 rpm, 4oC, 3 min (＊)
- Wash: 1 % BSA / PBS 500 μl 遠心は＊
- Blocking: 1 % BSA / PBS 500 μl, on ice, 1 hr
- ＊
- （※以下遮光）デカントでsupを捨て（残り約50 μl,）、FITC-CD8a
(BD Pharmingen, 553030)を1 μlずつ加える。 On ice, 1 hr - ＊
- Wash: 1 % BSA / PBS 500 μl 遠心は＊
- 300 μlのPBS (4oC)を加えてresuspend。700 μlのcold ethanol (4oC)を加え、全体が均一になるようにピペッティング。 4oC, 1 hr, rotator
- 10,000 rpm, 4oC, 3 min
- Wash: 1 % BSA / PBS 500 μl 遠心は7,000 rpm, 4oC, 3 min
- Wash: PBS 500 μl 遠心は8,000 rpm, 4oC, 3 min
- PI+: PBS / 10 _g/ml PI / 1 mg/ml RNaseAを500 μl加える。
PI-: PBS / 1 mg/ml RNaseAを500 μl加える。 RT, 30 min - FACS caliburへ
FACS caliburによるflow cytometry (FITC, PI)
1. 準備
i) 機械のセットアップ
- 廃液が残っていたら捨てる。廃液タンクにブリーチ（FACS clean）を40 ml（底が浸るくらい）入れる。
シース液の残量を確認。足りなかったら加える。- VOLTAGE B TYPE（足元左側）のスイッチON
- FACSの電源ON（装置右側面下）
- PC起動
- シースタンクに圧をかける。
- サポートアームを左右どちらかにずらしてMilli-Qの入ったtubeを外し、PRIMEを押す。STANDBY に戻ったら再びPRIMEを押す。計3回PRIMEを行う。
- Milli-Qの入ったtubeをセットし、サポートアームを元の位置に戻す。
ii) CELL QUESTのセットアップ
appleマーク
_コントロールパネル
_BD PAK
StatusがReadyであることを確認する。
↓
appleマーク
_CELL QUEST起動
↓
以下の6つのパネルを開く
Acquire
_Connect to cytometer
_Counters
Cytometer
_Detector/Amps
_Threshold
_Compensation
_Status
↓
Detector/AmpsのP3、P4、P5のModeを“Lin”から“Log”にする。
Detector/AmpsのDDM parameterを“FL3”にする。
↓
グラフの表示 −ドットプロット
Plots
_Dot plot
以下の5つのグラフを表示
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Plot sources | Acquisition → analysis |
Acquisition → analysis |
Acquisition → analysis |
Acquisition → analysis |
Acquisition → analysis |
| Options | Show “all dots” |
Show “all dots” |
Show “all dots” |
Show “all dots” |
“Show all dots” |
| X parameter | FSC 1024 | FL1-H | FL1-H | FL3-A | FL1-H |
| Y parameter | SSC 1024 | FL2-H | FL3-H | FL3-W | FL3-A |
| 備考 | region 1の設定 | Voltage Compensation | Voltage Compensation | ダブレット除去region 2の設定 | region 3の設定 |
↓
グラフの表示 −ヒストグラムプロット
Plots
_Histogram plot
以下の2つのグラフを表示
| 1 | 2 | |
| Plot sources | Acquisition → analysis |
Acquisition → analysis |
| parameter | FL1-H | FL3-A |
| 備考 | FITC+ cellが どれだけいるか？ |
PIの入り具合 目的のプロット |
ツールバーのQuadrant Markerツールを選択。
FL1-H・FL2-H、FL1-H・FL3-Hのドットプロットの (x, y) = (101, 101)を交点としてマーキング。
↓
最後に、データの保存先を入力。
Acquire
_Parameter description
保存先を選択
データ取り込みの方法
サポートアームを左右どちらかにずらしてサンプルの入ったtubeをセット。サポートアームをすぐに元の位置に戻す（戻さないままだとサンプルが吸われてしまう）。
↓
Acquisition control の■set up チェック入れる。
↓
FACS本体の設定が Lo になっていることを確認し、RUN ボタンを押す。
ボタンが緑にならずオレンジのままの場合はPC、FACS再起動。
↓
Acquisition control
“Acquire” 取り込む
“Pause” 止まる
“Abort” 消す
これらを繰り返し、補正・測定を行う。
＊長くとめる場合はSTANDBY を押す。
＊Counterを見て、取り込みが遅い場合は一旦Pause→STANDBYにしてサンプルをvortexする。
2. FITC−PI− → gate 1の設定、voltageの設定
i) FSC-H・SSC-Hのドットプロットを用いてgate 1の設定を行う。
FITC−PI−サンプルをセット。“Acquire”で取り込みながら、細胞集団がグラフの真ん中あたりに集まることを確認する。
↓
ツールバーの囲みツールをクリックし、高密度の部分を選択する。“R1”と表示される。
ii) voltageの調節
- FL1-H・FL2-H、FL1-H・FL3-Hのドットプロット、およびFL3-Aのヒストグラムについて。
Plot
_Format dot plot
Gate“G1 = R1”にする。 
“Acquire”で取り込みながら、FL1-H・FL2-H、FL1-H・FL3-Hのドットプロットのx, y共に101以下にドットが収まるよう、Detector/Ampsのvoltage
(P1〜3)を調節する。
“Acquire”で取り込みながら、FL3-Aヒストグラムのx軸300〜400と600〜800の辺りに2本のピークがくるようにvoltage P3を微調節する。
3. FITC−PI＋ → ダブレット除去、gate 2の設定
i) ダブレット除去
- FL3-W・FL3-Aのドットプロットについて。
Plot
_Format dot plot
Gate“G1 = R1”にする。 - FITC−PI＋サンプルをセット。“Acquire”で取り込み、Detector/AmpsのAmp gain P7を1.5〜2にする（取り込みながら見やすい値に調節）。
囲みツールを用いて高密度の部分を選択する。
“R2”と表示される。
ii) Gate 2（G2）の設定
Gates
_Gate list
G2を“R1*R2”と入力
4. FITC＋PI− → compensation
FL1-H・FL3-Hのドットプロットについて（gateはG1 = R1のまま）。
FITC＋PI−サンプルをセット。
“Acquire”で取り込みながら、細胞が
FL3-Hの101以下に収まるように
Compensationの“FL2−%FL1”を上げる。
5. FITC＋PI＋ → gate 3の設定、測定
まず、Format Dot Plotから各グラフのgateを以下のように設定。
FSC-H・SSC-Hドットプロット → no gate
FL1-H・FL2-Hドットプロット → G2 = R1*R2
FL1-H・FL3-Hドットプロット → G2 = R1*R2
FL3-W・FL3-Aドットプロット → G1 = R1
FL1-H・FL3-Aドットプロット → G2 = R1*R2
FL1-Hヒストグラムプロット → G2 = R1*R2
FL3-Aヒストグラムプロット → とりあえずG2 = R1*R2
FL3-Aのヒストグラムプロットについて。
FITC＋PI＋サンプルをセット。“Acquire”で取り込み、
囲みツールを用いてFITCポジティブの部分を選択する。
“R3”と表示される。
i) Gate 3（G3）の設定
- Gates
_Gate list
G3を“R1*R2*R3”と入力 - FL3-AヒストグラムプロットについてG3 = R1*R2*R3にする。
ii)測定
- Acquire
_Acquisition & storage
Collection criteria
Acquisition will stop when“10000”of“G3 = R1*R2*R3”events are counted
にする。 - Acquisition control の set up チェック外す。
- “Acquire”
＊取り込みが遅くなったら途中で“Pause”にしてvortexにかけてもよい。
6. 片付け
- ブリーチのtube（2 ml以上）をセットし、サポートアームを左右どちらかにずらした状態でRUN を押す。そのまま1分間。
- Milli-Qのtube（2 ml以上）をセットし、サポートアームを左右どちらかにずらした状態で RUN を押す。そのまま1分間。
- ブリーチのtube（2 ml以上）をセットし、サポートアームが中央の状態にする。 flow rate を HIGH にし、RUN を押す。そのまま5分間。
- Milli-Qのtube（2 ml以上）をセットし、サポートアームが中央の状態にする。 flow rate を HIGH にし、RUN を押す。そのまま5分間。
- シース圧を解除する。使用記録をつけ、PCの電源を落とす。廃液を捨てる。
- 5分間おいた後、FACSの電源2ヶ所OFF。