Google
お知らせ 研究室メンバー 研究内容 発表論文 実験プロトコル

実験プロトコル

Flow cytometryのための表面抗原染色(FITC, PI)

  1. Cell
  2. PBS wash 4 ml x 3 times
  3. 0.5 mM EDTA / PBSを1 ml加え、RT, 10 min.
  4. 回収。500 μlのPBSで洗いこむ。
  5. 2,000 rpm, 4oC, 3 min  (*)
  6. Wash: 1 % BSA / PBS 500 μl 遠心は*
  7. Blocking: 1 % BSA / PBS 500 μl, on ice, 1 hr
  8. (※以下遮光)デカントでsupを捨て(残り約50 μl,)、FITC-CD8a
    (BD Pharmingen, 553030)を1 μlずつ加える。 On ice, 1 hr
  9. Wash: 1 % BSA / PBS 500 μl 遠心は*
  10. 300 μlのPBS (4oC)を加えてresuspend。700 μlのcold ethanol (4oC)を加え、全体が均一になるようにピペッティング。 4oC, 1 hr, rotator
  11. 10,000 rpm, 4oC, 3 min
  12. Wash: 1 % BSA / PBS 500 μl 遠心は7,000 rpm, 4oC, 3 min
  13. Wash: PBS 500 μl 遠心は8,000 rpm, 4oC, 3 min
  14. PI+: PBS / 10 _g/ml PI / 1 mg/ml RNaseAを500 μl加える。
    PI-: PBS / 1 mg/ml RNaseAを500 μl加える。 RT, 30 min
  15. FACS caliburへ

 

FACS caliburによるflow cytometry (FITC, PI)

1. 準備

i) 機械のセットアップ

  1. 廃液が残っていたら捨てる。廃液タンクにブリーチ(FACS clean)を40 ml(底が浸るくらい)入れる。
  2. シース液の残量を確認。足りなかったら加える。
  3. VOLTAGE B TYPE(足元左側)のスイッチON
  4. FACSの電源ON(装置右側面下)
  5. PC起動
  6. シースタンクに圧をかける。
  7. サポートアームを左右どちらかにずらしてMilli-Qの入ったtubeを外し、PRIMEを押す。STANDBY に戻ったら再びPRIMEを押す。計3回PRIMEを行う。
  8. Milli-Qの入ったtubeをセットし、サポートアームを元の位置に戻す。

ii) CELL QUESTのセットアップ

appleマーク
_コントロールパネル
  _BD PAK
StatusがReadyであることを確認する。

appleマーク
_CELL QUEST起動

以下の6つのパネルを開く
Acquire
_Connect to cytometer
_Counters
Cytometer
_Detector/Amps
_Threshold
_Compensation
_Status

Detector/AmpsのP3、P4、P5のModeを“Lin”から“Log”にする。
Detector/AmpsのDDM parameterを“FL3”にする。

グラフの表示 −ドットプロット
Plots
_Dot plot
以下の5つのグラフを表示

  1 2 3 4 5
Plot sources Acquisition
→ analysis
Acquisition
→ analysis
Acquisition
→ analysis
Acquisition
→ analysis
Acquisition
→ analysis
Options Show
“all dots”
Show
“all dots”
Show
“all dots”
Show
“all dots”
“Show
all dots”
X parameter FSC 1024 FL1-H FL1-H FL3-A FL1-H
Y parameter SSC 1024 FL2-H FL3-H FL3-W FL3-A
備考 region 1の設定 Voltage Compensation Voltage Compensation ダブレット除去region 2の設定 region 3の設定


グラフの表示 −ヒストグラムプロット
Plots
_Histogram plot
以下の2つのグラフを表示

  1 2
Plot sources Acquisition
→ analysis
Acquisition
→ analysis
parameter FL1-H FL3-A
備考 FITC+ cellが
どれだけいるか?
PIの入り具合
目的のプロット

ツールバーのQuadrant Markerツールを選択。
FL1-H・FL2-H、FL1-H・FL3-Hのドットプロットの (x, y) = (101, 101)を交点としてマーキング。


最後に、データの保存先を入力。
Acquire
_Parameter description
  保存先を選択

データ取り込みの方法

サポートアームを左右どちらかにずらしてサンプルの入ったtubeをセット。サポートアームをすぐに元の位置に戻す(戻さないままだとサンプルが吸われてしまう)。

Acquisition control の■set up チェック入れる。

FACS本体の設定が Lo になっていることを確認し、RUN ボタンを押す。
ボタンが緑にならずオレンジのままの場合はPC、FACS再起動。

Acquisition control
“Acquire” 取り込む
“Pause” 止まる
“Abort” 消す
これらを繰り返し、補正・測定を行う。
  *長くとめる場合はSTANDBY を押す。
*Counterを見て、取り込みが遅い場合は一旦Pause→STANDBYにしてサンプルをvortexする。

2. FITC−PI− → gate 1の設定、voltageの設定

i) FSC-H・SSC-Hのドットプロットを用いてgate 1の設定を行う。

FITC−PI−サンプルをセット。“Acquire”で取り込みながら、細胞集団がグラフの真ん中あたりに集まることを確認する。

ツールバーの囲みツールをクリックし、高密度の部分を選択する。“R1”と表示される。

 

ii) voltageの調節

  1. FL1-H・FL2-H、FL1-H・FL3-Hのドットプロット、およびFL3-Aのヒストグラムについて。
    Plot
    _Format dot plot
    Gate“G1 = R1”にする。
  2. “Acquire”で取り込みながら、FL1-H・FL2-H、FL1-H・FL3-Hのドットプロットのx, y共に101以下にドットが収まるよう、Detector/Ampsのvoltage (P1〜3)を調節する。
  3. “Acquire”で取り込みながら、FL3-Aヒストグラムのx軸300〜400と600〜800の辺りに2本のピークがくるようにvoltage P3を微調節する。

 

3. FITC−PI+ → ダブレット除去、gate 2の設定

i) ダブレット除去

  1. FL3-W・FL3-Aのドットプロットについて。
    Plot
    _Format dot plot
    Gate“G1 = R1”にする。
  2. FITC−PI+サンプルをセット。“Acquire”で取り込み、Detector/AmpsのAmp gain P7を1.5〜2にする(取り込みながら見やすい値に調節)。
  3. 囲みツールを用いて高密度の部分を選択する。
    “R2”と表示される。

ii) Gate 2(G2)の設定

Gates
_Gate list
G2を“R1*R2”と入力

4. FITC+PI− → compensation

FL1-H・FL3-Hのドットプロットについて(gateはG1 = R1のまま)。

FITC+PI−サンプルをセット。
“Acquire”で取り込みながら、細胞が
FL3-Hの101以下に収まるように
Compensationの“FL2−%FL1”を上げる。

5. FITC+PI+ → gate 3の設定、測定

まず、Format Dot Plotから各グラフのgateを以下のように設定。

FSC-H・SSC-Hドットプロット → no gate
   FL1-H・FL2-Hドットプロット → G2 = R1*R2
   FL1-H・FL3-Hドットプロット → G2 = R1*R2
   FL3-W・FL3-Aドットプロット → G1 = R1
   FL1-H・FL3-Aドットプロット → G2 = R1*R2
   FL1-Hヒストグラムプロット  → G2 = R1*R2
   FL3-Aヒストグラムプロット  → とりあえずG2 = R1*R2

FL3-Aのヒストグラムプロットについて。
FITC+PI+サンプルをセット。“Acquire”で取り込み、
囲みツールを用いてFITCポジティブの部分を選択する。
“R3”と表示される。

i) Gate 3(G3)の設定

  1. Gates
    _Gate list
    G3を“R1*R2*R3”と入力
  2. FL3-AヒストグラムプロットについてG3 = R1*R2*R3にする。

ii)測定

  1. Acquire
    _Acquisition & storage
    Collection criteria
    Acquisition will stop when“10000”of“G3 = R1*R2*R3”events are counted
    にする。
  2. Acquisition control の set up チェック外す。
  3. “Acquire”
    *取り込みが遅くなったら途中で“Pause”にしてvortexにかけてもよい。

6. 片付け

  1. ブリーチのtube(2 ml以上)をセットし、サポートアームを左右どちらかにずらした状態でRUN を押す。そのまま1分間。
  2. Milli-Qのtube(2 ml以上)をセットし、サポートアームを左右どちらかにずらした状態で RUN を押す。そのまま1分間。
  3. ブリーチのtube(2 ml以上)をセットし、サポートアームが中央の状態にする。 flow rate を HIGH にし、RUN を押す。そのまま5分間。
  4. Milli-Qのtube(2 ml以上)をセットし、サポートアームが中央の状態にする。 flow rate を HIGH にし、RUN を押す。そのまま5分間。
  5. シース圧を解除する。使用記録をつけ、PCの電源を落とす。廃液を捨てる。
  6. 5分間おいた後、FACSの電源2ヶ所OFF。