大腸菌の蛋白質発現
GST-、MBP-、His6-fusion proteinの発現check
50％ beadsの準備
- Glutathione sepharose beads ＝ GST-fusion protein
- Amylose resin ＝ MBP-fusion protein
- NiNTA-Agarose ＝ His6-fusion protein
- ビーズを15ml corning tubeにとり遠心1000rpm、2分
- supを除く
- 50mM Tris-HCl pH 7.4、100mM NaCl 10mlにresuspend
- 遠心1000rpm、2分
- 1.〜3.×4回
- 50mM Tris-HCl pH 7.4、100mM NaClで50%になるようにresuspendし、4℃保存
前日
- 培養dishから1コロニーずつ竹串で削り、15mlのtwo position tubeに入れたLB-Amp培地5mlにinoculate（無菌操作）
- 37℃でincubate、over night
当日 a.m.
- tubeからLB-Amp 45ml入れた100ml culture bottleに移す
- 37℃でincubate、60min
- 30℃でincubate、30min
この間に,IPTG(0.2g/ml) stockを出し、water in iceで溶かす - IPTG(0.2g/ml) stock 10μl加える
- 30℃でincubate、3時間
当日 p.m
- culture bottleから50mlのcorning tubeに移す
- 遠心3300rpm、10分
この間に1.5cc tube(サンプル数×2)を冷やしておく. - Supを捨て,tubeを逆さにしてしばらく立てておき,滴を落とす.
- PelletにBuffer A(50mM Tris-HCl pH 7.4, 100mM NaCl) 1mlを加える.
- Sonication 10sec×6.
- 20% Triton X-100を50μl加える（final 1%）
- ブルーチップで1.5cc tubeに移す
- 遠心15000rpm、2分、4℃
- Supを別の1.5cc tubeに移す（pelletはon iceで置いておく）・・・＊へ
- 適切な50％ beadsを20μl加える
- パラフィルムでシールし、低温室のrotorでincubate、２時間
- 遠心 1000rpm、5min分、4℃
- Supをブルーチップで取り除く
- PelletにBuffer Aを400μl加える
- 12.〜14. ×4回繰り返す
- ４回washが済んだら、PelletにBuffer Aを60μl加え、3×SDS stopping bufferを30μl加える
- 98℃、5分、boil
＊pelletはBuffer Aを１ml加えsonicationし、うち100μlに3×SDS stopping bufferを50μl加え、不溶性画分とする。 - 98℃、5分、boil
- ビーズに結合したもの、不溶性画分それぞれ別々にSDS-PAGE
- CBB染色、緩やかに振盪、20分
- 脱色。脱色液と染色液吸着用にキムワイプを入れ,ラップをかけて電子レンジ強2分で強制脱色
- 緩やかに振盪して脱色する
ゲルの乾燥
- 吸引器の周囲に氷を入れる.
- ゲルを濾紙上にしわができないように広げる.
- 台紙の上に濾紙＋ゲルを乗せ、ラップをしわなくかける.
- シートをかけ、吸引開始.
- 70℃、60分にセットし、RUNを押す
- シートを外してから、吸引を終了する
- 氷をかたづける