ベクター構築
- ゲノムPCR(25μlの系)
- 20 μlをagarose電気泳動して評価
5 μlはTA-cloning用にon iceで保存しておく - TA-TOPO cloning
- colony拾って2 μl culture開始(8 clone程度、master plate作成)
- mini-prep
EcoR1でdigestしてinsert確認 - 50 ml culture開始(4 clone程度)
- 制限酵素サイトのマッピング、制限酵素選択
60μlの系でdigestion(4 clone程度)
同時にベクターpBluescriptUも100 mlの系でdigestion - 1段agarose電気泳動
- fragment isolation
- ligation
- calcium competent cellにtransform (XL1blue)
- color selection
- colony pick up(各5clone程度、master plate作成)
- mini-prep
KpnT/ SacTでdigestしてinsert確認 - 5 ml culture開始(2 clone程度)
- Qiagen spin columnでDNA prep.
- Sequence反応PCR
- SequencerでSequenceを確認
TA-TOPO cloning
用意
TOPO isomerase (pCR4-TOPO : Invitrogen)
- PCRが終了して電気泳動を開始したら、
25℃、42℃のwater bathをつける
↓以下の順で1.5 cc tubeに混合sterile water 3 μl PCR産物 1μl TOPO isomerase (pCR4-TOPO) 1μl 5 ml - フローターにさして、25℃、5分
- on ice、add 50μl competent cell (TOP10)
- on ice、20分
- 42℃、heat shock、1分
- on ice、add 300 ml S.O.C. medium (or LBamp / LBKM)
- 37℃ water bath、30分
- 全量10cmプレート(LBamp or LBKM)にまく
- 37℃、air incubator、overnight
Miniprep (express mini)
準備:
- autoclavedエッペンチューブ(×sample×2)
- non-autoclavedエッペンチューブ(×sample)
- TEG[Tris-EDTA-glucose]
- アルカリ(2% SDS-0.2N NaOH)
- TE/RNase[TE+ 10mg/ml RNase]
- 15ml two position tubeの蓋をすべて取り、遠心3,300rpm 8min RT
- 発泡スチロールのチューブ立てにtubeを立て、Supをまとめて捨て、 キムタオルの上で逆さにして水切りする
- TEG【100μl】入れ、発泡スチロールの台ごとまとめてVortex
→上から見てresuspendの確認をする - アルカリ【200μl】加え、5min置いてアルカリ化
→Vortex禁止(chromosomal DNAが出てきてしまうから) - 5M KOAc【150μl】加え、まとめてVortex
- フェノール/クロロホルム【100μl】加え、まとめてVortex
- decantでnon-autoclavedエッペンへ移す
- 遠心15,000rpm 3min RT
- 透明なSup【500μl】をautoclavedエッペンへ移す
- cold 100% エタノール【1ml】をガラスピペットで加えて、転倒混和
→エタノール濃度が66.6%以上になればよいのでエッペンの縁少し下まで いれればよい - 遠心15,000rpm 15min 4℃
- Supを捨てて100% EtOH【200-300μl】をガラスピペットで加える
→混和はしない - Supを捨てて、チューブを立てかけて軽く乾燥させ、speed vac 2minで乾燥させる
- TE/RNase【25-40μl】を加えてRNAを失活させる
溶けるまでVortex 3min RT - 4〜5μlを20μlの系でdigestionし、insert確認
DNA digestion for fragment isolation
DNA digestion (60 mlの系)
MaximiniのDNA | 4 μl |
10×buffer | 6 μl |
TE | 38 μl |
制限酵素1 | 0.5 μl |
制限酵素2 | 0.5 μl |
50 μl |
- 37℃、water bath、2時間消化
- 10 ml 6×loading buffer加えて、
- 1段1% agaroseゲルで200 mA、120分電気泳動(各2レーン、30 mlずつ)
DNA digestion (100 mlの系-pBluescriptUベクター)
MaximiniのDNA | 5 μl |
10×buffer | 10 μl |
TE | 83 μl |
制限酵素1 | 1 μl |
制限酵素2 | 1 μl |
100 μl |
- 37℃、water bath、2時間消化
- 20 ml 6×loading buffer加えて、
- 1段1% agaroseゲルで200 mA、120分電気泳動(各4レーン、30 mlずつ)
一種類の酵素で消化した時は電気泳動する必要がない(fragmentないから)。
かわりに、self ligationを阻止するためにCIAP処理を行う。
100 μl digest
+ 10 μl 10×buffer
+ 1 μl enzyme (alkali phosphatase from calf intestine)
37℃、water bath、2時間消化し、ligationに用いる。
Fragment isolation
↓ 各2レーン分まとめてバンドを切り出し、1.5cc tubeへ
↓ ブルーチップでゲルをつぶす
↓ 300 ml フェノールを加える
↓ vortex mixer、max、1分
↓ フローターにさして、-80℃、10分
この間に1.5cc tubeを3 set用意
↓ 遠心15000rpm、8分、R.T.
↓ supを別のtubeへ
↓ 100 ml フェノールと100 ml クロロホルムを加える
↓ vortex mixer、max、1分
↓ 遠心15000rpm、3分、R.T.
↓ supを別のtubeへ
↓ 100 ml クロロホルムを加える
↓ vortex mixer、max、1分
↓ 遠心15000rpm、3分、R.T.
↓ supを別のtubeへ
↓ 1/10量 3M NaOAc (30 ml)を加える
↓ 2.5倍量 cold EtOH (750 ml)を加える
↓ よくvortexし、遠心15000rpm、13分、4℃
↓ pptがあることを確認し、supをデカントですてる
↓ 70% EtOH (R.T.)を500 ml加える
↓ すぐにすててキムワイプの上で逆さにする
↓ speed vac乾燥、2分
↓ 40 mlのTEにresuspend
Ligation、transformation into XL1blue
Ligation
DNA digestion (60 mlの系)
pBluescriptUKS(-) | 1 μl |
isolated fragment | 4 μl |
10×ligase buffer | 1 μl |
T4 DNA ligase | 0.1 μl |
TE | 4 μl |
10 μl |
16℃、water bath、12時間
Transform
Ligated sample
↓ on ice、50 μl calcium competent cell (XL1blue)を加える
↓ on ice、20分
↓ この間に、10cm LBamp or LBkm plateに
200 μl 60mg/ml X-gal/DMFをコンラ−ジ棒で塗布
静置、2分
100 μl 30mg/ml IPTG/DWをコンラ−ジ棒で塗布
↓ heat shock、42℃、1分
↓ on ice、LBampを500 ml加える(5 mlピペットで適当に)
↓ 37℃、water bath、30分
↓ 遠心、flash
↓ supをデカントですて、pelletの大腸菌をイエローチップでプレートにまく
↓ 37℃、air incubator、12時間
QIAprepカラムを用いたMiniprep (for sequence)
前日に大腸菌5ml culture start
37℃、overnight
↓15mlチューブのフタをとって、大実験室の床の遠心機で遠心(3300rpm、8分)して大腸菌をペレットにする。
↓白い発泡スチロールの台にチューブをさして、ひっくりかえして上清すてる。
↓Buffer P1を250 μl入れて、ボルテックス。1.5ccチューブにデカントでうつす(Buffer P1にRNaseが加えてあることを確認)。
↓1.5ccチューブに250 μlのbuffer P2を加えて静かに転倒混和5回。
↓350 mlのbuffer N3を加えて静かに転倒混和5回。
↓遠心(13000rpm、10分、室温)。
↓上清液をキアゲンカラム(青いカラム)にデカントでうつす。
↓遠心(13000rpm、1分、室温)。
↓下の白いチューブ内の液をブルーチップを用いてすてる。
↓750 mlのbuffer PEを加えて、遠心(13000rpm、1分、室温)。
↓下の白いチューブ内の液をブルーチップを用いてすてる。
↓再度遠心(13000rpm、1分、室温)。
↓青いカラムを新しい1.5ccチューブにのせて、カラムのまん中にTEを50 μl入れる。
↓遠心(13000rpm、1分、室温)。
↓1.5ccチューブ内にサンプルが50 ml回収される。カラムはすてる。
DNAの定量(5 μlのサンプルをとって、95 μl TEとまぜる)。
Sequence
Sequence反応
- 0.1mg/ml DNAを1.5CC tubeに調整
- 1ml DNA + DW (OD-0.1)×10ml
PCR tube | ||
0.1μg/ml DNA | 1 μl (100ng) | ×本数分用意し、8.8 μlずつ分注 |
DW | 6.5 μl | |
Primer | 1 μl | |
Enzyme mixture (ver.3) | 1.5 μl | ×本数分用意し、8.8 μlずつ分注 |
10 μl |
Primer
Forward(F)、reverse(R)、278(T3)、279(T7) → for TA vector
278(T3)、279(T7) → for
pBluescriptU vector
PCR条件
プログラムabi→exp big
95℃になったら入れる
96℃ 1 min ┐
96℃ 10 sec │
50℃ 5 sec ├25 cycle
60℃ 4 min ┘
4℃ ∞
↓
-20℃保存可
Sequence反応後からSequenceまで
1.5cc tube
↓ add 15 ml DW
↓ add 65 ml 99.5% EtOH (R.T.のでよい)
↓ add PCR産物
↓ tube mixer、max、1分
↓ 静置、15分
↓ 遠心15000 rpm、20分、室温(ヒンジ側を外側にして)
↓ イエローチップを100 mlに設定し、ヒンジ側の反対側からEtOHを吸って除去
↓ add 250 ml 70% EtOH
↓ 遠心15000 rpm、5分、室温
↓ デカントでEtOHを除去
↓ キムタオルの上で逆さにする
↓ speed vac、4分*チューブ立てに立ててアルミホイルで包んで-20℃保存可
↓ add 16 ml ホルムアミド(HiDiホルムアミド)
↓ tube mixer、max、1分
↓ IWAKIのヒートブロック、96℃、2分
↓ 急冷、on ice、5分
↓ サンプルを96ウェルにチャージ
イエローチップを18 mlに設定して処理
* sequenceには16の倍数分のサンプルが必要
サンプル数が16の倍数でない時は残りのウェルにホルムアミドのみを入れる。
Sequencerの使い方
1. パソコンの設定
- DELL(sequencer用PC)電源ON
- windows立ち上がる→Ctrl+Alt+Delete→OK
- タスクバーにOrbix Web Daemonがあることとを確認
- sequencer ON 黄色→青色になるのを待つ
- 3100 data collectionクリック
- sequencerのtrayボタンを押す→トレイが左手前にくる
- トレイを取り出し、(必ず左手前で停止してから取り出す)、どこからサンプルをチャージできるかを確認。トレイは取り出して外に置いておく
- NEWをクリックし、データを入力してゆく
plate name : 日付け入力 050321など
application : sequencing
plate type : 96 well
→finish - サンプル名入力 H12-R、H12-T3など
Dye set → Z
Mobility File → DT3100 POP6 {BDv3} v1.mob
BioLMS Project → 3100 Project 1
Run Module → StdSeq 50 POP6 Defalt Module
Analysis Module → BC-3100 SeqOffFtOff
OK
→ pending plate recordテーブルに新しいplate recordが加わる
2. ゲルの交換
用意するもの
- プラスチック20ml容シリンジ(秤の下の箱の中に専用のがある)
- milliQ水を1リットル容ビーカーに800ml入れ、電子レンジ強で2分加熱
- ゲル、buffer
- sequencerの左の扉を開く、レーザー部を開く
- シリンジ2本、ブロック2つ、bufferの入った小ビンをはずす
- レーザー部はすぐ閉じる
- 2本のシリンジのゲルを押し出し、廃棄
- シリンジの先、ブロックの周りをビーカー内で洗う
(シリンジの中は洗ってはいけない) - ブロックの内部を洗う
プラスチック20ml容シリンジを使って、ブロック内部にmilliQ水を通す - シリンジの先、ブロックの周りをキムタオルで拭う
- ブロックの内部の水滴をエアーダスターを使用して飛ばす
- シリンジにゲルを充填する
大きいシリンジ → 約1 ml
小さいシリンジ → 約150 ml - シリンジ2本、ブロック2つ、bufferの入った小ビンを元通り接続する
Tool → Change Polymer Wizard
ブロック内部のair抜きのところまで、指示に従いゲルのロットなどを記入
ブロック内部のair抜き
Change Polymer Wizardの指示に従う
↓ sequencer内のライトをつける
↓ 大きいシリンジを押し、大きいシリンジと小さいシリンジからの交点まで
ゲルを満たす
↓ 小さいシリンジを押し、大きいシリンジからのゲルと合わせる
↓ 大きいシリンジを押し、ゲルを下のブロックまで満たし、air抜きをする
↓ FINISHする
Tool → Perform Spatial Calibrationでキャリブレーションを2回行う
Detail checkして乱れがないか確認する
3. Bufferの交換
4つのトレイ、bufferの入った小ビンを取り出し、トレイ、トレイのフタ、小ビンをmilliQ水でよくすすぐ
↓ 3つのトレイ内の線のところまでmilliQ水を入れる
↓ トレイのフタの部分はキムタオル上でたたいて水滴をきる
↓ bufferを入れるトレイと小ビンの中の水滴はキムワイプで拭う
↓ 10×buffer(白いフタつきの入れ物)5 mlとmilliQ水 45 mlを50cc corning tubeに入れて混ぜる
↓ bufferを入れるトレイと小ビンにbufferを入れる
↓ 左手前にbufferが入ったトレイが来るようにsequencerにセットする
4. Sequence開始
Sequence反応後、EtOH沈殿したDNA
↓ add 16 ml ホルムアミド(HiDiホルムアミド)
↓ tube mixer、max、1分
↓ IWAKIのヒートブロック、96℃、2分
↓ 急冷、on ice、5分
↓ イエローチップを18 mlに設定サンプルを96ウェルにチャージ
(泡ができないように注意)
トレイをsequencerに戻す→トレイAが認識される
↓ data (pending plate records)をクリックしてactiveにする
↓ トレイAをクリック
↓ linked plate recordsに認識される
↓ 緑の△印をクリックしてrun
↓ status viewで電圧をチェックする(70 ̄80mAくらいになるはず)
↓ ときどきrun viewでsequenceの様子をチェックする
5. sequenceの解析
PC画面でsequenceの終了を確認し、sequencerをOFFにする
デスクトップ
↓ sequence analysis
↓ add file
↓ applied bic
↓ 3100
↓ data extractor
↓ extracted runs
↓ 今日の日付けのfile
↓ add all
↓ finish
*peak1 locationとstart pointを400にする
↓ Aのところの□をクリックして×印をつける
↓ start
デスクトップ
↓ short cut to extracted runs
↓ 今日の日付けのfile
新たにフォルダを作り、textのみを入れ、フロッピーディスクに保存
QIAGEN Maxi Plasmid Purification
前日
大腸菌をinoculate 50 ml culture×2本、24時間shake
大きいベクターの場合は50 ml culture×10本、12時間shake
↓
当日
高速遠心機、rotor 25番を冷却する。
P1(RNaseが入っていることを確認)
P3 on iceで冷やしておく
↓e.coli c.f.g. (大実験室のSwing rotor、3300rpm、20分)
↓p.p.t.に 10 ml P1を加え、vortex
(1本にいれてresuspendしたら、もう1本に移してresusupend)
↓add 10 ml P2 フタをして転倒混和5回(vortexしない)
↓R.T.、5分
↓add 10 ml P3フタをして転倒混和10回
↓on ice、20分
↓c.f.g. 高速遠心機、rotor 25番 10,000 rpm、15分、4℃
ここからはガラスでなくディスポのピペットを使用する
QIAGEN-tip500を50 cc Falcon tubeにのせる
↓add 10 ml QBT(50 cc Falcon tubeのフタを上にのせる)(カラムの平衡化)
↓遠心した上清をカラムにデカントでのせる(吸着)
↓add 30 ml QC×2 (wash)
↓カラムを新しい50 cc Falcon tubeにのせる
↓add 15 ml QF (elution)
↓add 10.5 ml イソプロパノール(ここからはガラスのピペットでよい)
↓mix well
↓c.f.g. (rotor 25番 10,000 rpm、30分、4℃ 白いラベルを外に向けておく)
↓
p.p.t (=DNA) supはデカントですてる
↓add 5 ml 70% EtOH
↓c.f.g. (大実験室のSwing rotor、3300rpm、10分)
↓p.p.t.(上清をそっとデカント。無理ならブルーチップで吸う)
↓風乾 約1時間(Falcon tubeをたてて上にキムタオルをかぶせる)
↓
TE 500mlにresuspendし、1.5 cc microtubeに移す
O.D.測定
カルシウムコンピテントセルの作製
塩化カルシウムによって膜の透過性を変化させる方法
前日
LB 1リットル×2(2リットル容フラスコ×2)
高速遠心ローター30番用の遠沈管6本(アルミホイルでつつむ)をオートレーブ
XL1Blue を10ml LB(100ml容ボトル)にinoculate
↓37℃、shake、overnight
当日
高速遠心ローター30番用を冷やしておく
OD測定のblank用として、フラスコからLBを一部抜く(5mlくらい)
XL1Blue 10mlを各2リットルフラスコのLB1リットルへ
↓37℃、shake、1時間
↓OD600測定
ここからは約30分おきにOD600を測定
OD600=0.4が最適(OD600=0.5以上にならないように注意)
↓ここからは常にon iceまたは4℃で作業する。
プラスチックのディスポのピペットを使用する。
↓OD600=0.4になったら、高速遠心ローター30番で遠心、8000rpm、6分
↓p.p.t.を約400mlのbuffer A
(10 mM PIPES pH7.0、60 mM CaCl2、15% glycerol)にresuspend
(ローター30番用遠沈管8分目くらい)
↓高速遠心ローター30番で遠心、3000rpm、6分
↓p.p.t.を約100mlのbuffer Aにresuspend(50cc corning tube 2本)
↓分注器、オートクレーブ済み1.5cc tube、液体窒素in大きい方の入れ物を用意
on iceで500ミクロずつ分注(1.5 cc tube約200本)、すぐに液体窒素で凍結し、-80℃で保存
フェノールのつくりかた
Phenol、 Crystals (Wako 160-12725 500g)
↓5-クロロ-8-ヒドロキシキノリンを0.5g加える。
↓DW、1M Tris-HCl (pH8.0) 共に滅菌したものを約100 mlずつ加える
(デカントでよい、かなり適当)
↓37℃ water bathであたためてとかす
↓とけたら、室温にだす
↓2層になるので上清をpH試験紙でチェック。中性(pH7.0)になればよい。
ならなかったら、さらにDWと1M Tris-HCl (pH8.0)を加える。
↓しばらく放置
↓上清をpH試験紙でチェックをくり返す
↓overnightで室温に静置
↓
cold roomで保存