ベクター構築

1. ゲノムPCR（25μlの系）
2. 20 μlをagarose電気泳動して評価
   5 μlはTA-cloning用にon iceで保存しておく
3. TA-TOPO cloning
4. colony拾って2 μl culture開始（8 clone程度、master plate作成）
5. mini-prep
   EcoR1でdigestしてinsert確認
6. 50 ml culture開始（4 clone程度）
7. 制限酵素サイトのマッピング、制限酵素選択
   60μlの系でdigestion（4 clone程度）
   同時にベクターpBluescript�Uも100 mlの系でdigestion
8. 1段agarose電気泳動
9. fragment isolation
10. ligation
11. calcium competent cellにtransform (XL1blue)
12. color selection
13. colony pick up（各5clone程度、master plate作成）
14. mini-prep
    Kpn�T/ Sac�Tでdigestしてinsert確認
15. 5 ml culture開始（2 clone程度）
16. Qiagen spin columnでDNA prep.
17. Sequence反応PCR
18. SequencerでSequenceを確認

TA-TOPO cloning

用意
TOPO isomerase (pCR4-TOPO : Invitrogen)

1. PCRが終了して電気泳動を開始したら、 25℃、42℃のwater bathをつける
   ↓以下の順で1.5 cc tubeに混合

   sterile water	3 μl
   PCR産物	1μl
   TOPO isomerase (pCR4-TOPO)	1μl
   	5 ml

2. フローターにさして、25℃、5分
3. on ice、add 50μl competent cell (TOP10)
4. on ice、20分
5. 42℃、heat shock、1分
6. on ice、add 300 ml S.O.C. medium (or LB^amp / LB^KM)
7. 37℃ water bath、30分
8. 全量10cmプレート(LB^amp or LB^KM)にまく
9. 37℃、air incubator、overnight

Miniprep (express mini)

準備：

• autoclavedエッペンチューブ(×sample×2)
• non-autoclavedエッペンチューブ(×sample)
• TEG[Tris-EDTA-glucose]
• アルカリ（2% SDS-0.2N NaOH）

1. TE/RNase[TE+ 10mg/ml RNase]
2. 15ml two position tubeの蓋をすべて取り、遠心3,300rpm 8min RT
3. 発泡スチロールのチューブ立てにtubeを立て、Supをまとめて捨て、 キムタオルの上で逆さにして水切りする
4. TEG【100μl】入れ、発泡スチロールの台ごとまとめてVortex
   →上から見てresuspendの確認をする
5. アルカリ【200μl】加え、5min置いてアルカリ化
   →Vortex禁止(chromosomal DNAが出てきてしまうから)
6. 5M KOAc【150μl】加え、まとめてVortex
7. フェノール/クロロホルム【100μl】加え、まとめてVortex
8. decantでnon-autoclavedエッペンへ移す
9. 遠心15,000rpm 3min RT
10. 透明なSup【500μl】をautoclavedエッペンへ移す
11. cold 100% エタノール【1ml】をガラスピペットで加えて、転倒混和
    →エタノール濃度が66.6%以上になればよいのでエッペンの縁少し下まで いれればよい
12. 遠心15,000rpm 15min 4℃
13. Supを捨てて100% EtOH【200-300μl】をガラスピペットで加える
    →混和はしない
14. Supを捨てて、チューブを立てかけて軽く乾燥させ、speed vac 2minで乾燥させる
    
15. TE/RNase【25-40μl】を加えてRNAを失活させる
    溶けるまでVortex 3min RT
16. 4〜5μlを20μlの系でdigestionし、insert確認

DNA digestion for fragment isolation

DNA digestion (60 mlの系)

MaximiniのDNA	4 μl
10×buffer	6 μl
TE	38 μl
制限酵素1	0.5 μl
制限酵素2	0.5 μl
	50 μl

• 37℃、water bath、2時間消化
• 10 ml 6×loading buffer加えて、
• 1段1% agaroseゲルで200 mA、120分電気泳動（各2レーン、30 mlずつ）

DNA digestion (100 mlの系-pBluescript�Uベクター)

MaximiniのDNA	5 μl
10×buffer	10 μl
TE	83 μl
制限酵素1	1 μl
制限酵素2	1 μl
	100 μl

• 37℃、water bath、2時間消化
• 20 ml 6×loading buffer加えて、
• 1段1% agaroseゲルで200 mA、120分電気泳動（各4レーン、30 mlずつ）

一種類の酵素で消化した時は電気泳動する必要がない（fragmentないから）。
かわりに、self ligationを阻止するためにCIAP処理を行う。

100 μl digest
+ 10 μl 10×buffer
+ 1 μl enzyme (alkali phosphatase from calf intestine)
37℃、water bath、2時間消化し、ligationに用いる。

Fragment isolation

↓ 各2レーン分まとめてバンドを切り出し、1.5cc tubeへ
↓ ブルーチップでゲルをつぶす
↓ 300 ml フェノールを加える
↓ vortex mixer、max、1分
↓ フローターにさして、-80℃、10分
　この間に1.5cc tubeを3 set用意
↓ 遠心15000rpm、8分、R.T.
↓ supを別のtubeへ
↓ 100 ml フェノールと100 ml クロロホルムを加える
↓ vortex mixer、max、1分
↓ 遠心15000rpm、3分、R.T.
↓ supを別のtubeへ
↓ 100 ml クロロホルムを加える
↓ vortex mixer、max、1分
↓ 遠心15000rpm、3分、R.T.
↓ supを別のtubeへ
↓ 1/10量 3M NaOAc (30 ml)を加える
↓ 2.5倍量 cold EtOH (750 ml)を加える
↓ よくvortexし、遠心15000rpm、13分、4℃
↓ pptがあることを確認し、supをデカントですてる
↓ 70% EtOH (R.T.)を500 ml加える
↓ すぐにすててキムワイプの上で逆さにする
↓ speed vac乾燥、2分
↓ 40 mlのTEにresuspend

Ligation、transformation into XL1blue

Ligation

DNA digestion (60 mlの系)

pBluescript�UKS(-)	1 μl
isolated fragment	4 μl
10×ligase buffer	1 μl
T4 DNA ligase	0.1 μl
TE	4 μl
	10 μl

16℃、water bath、12時間

 

Transform

Ligated sample
↓ on ice、50 μl calcium competent cell (XL1blue)を加える
↓ on ice、20分
↓ この間に、10cm LB^amp or LB^km plateに
　　　200 μl 60mg/ml X-gal/DMFをコンラ−ジ棒で塗布
　静置、2分
　100 μl 30mg/ml IPTG/DWをコンラ−ジ棒で塗布
↓ heat shock、42℃、1分
↓ on ice、LB^ampを500 ml加える（5 mlピペットで適当に）
↓ 37℃、water bath、30分
↓ 遠心、flash
↓ supをデカントですて、pelletの大腸菌をイエローチップでプレートにまく
↓ 37℃、air incubator、12時間

QIAprepカラムを用いたMiniprep (for sequence)

前日に大腸菌5ml culture start

37℃、overnight
↓15mlチューブのフタをとって、大実験室の床の遠心機で遠心（3300rpm、8分）して大腸菌をペレットにする。
↓白い発泡スチロールの台にチューブをさして、ひっくりかえして上清すてる。
↓Buffer P1を250 μl入れて、ボルテックス。1.5ccチューブにデカントでうつす（Buffer P1にRNaseが加えてあることを確認）。
↓1.5ccチューブに250 μlのbuffer P2を加えて静かに転倒混和5回。
↓350 mlのbuffer N3を加えて静かに転倒混和5回。
↓遠心（13000rpm、10分、室温）。
↓上清液をキアゲンカラム（青いカラム）にデカントでうつす。
↓遠心（13000rpm、1分、室温）。
↓下の白いチューブ内の液をブルーチップを用いてすてる。
↓750 mlのbuffer PEを加えて、遠心（13000rpm、1分、室温）。
↓下の白いチューブ内の液をブルーチップを用いてすてる。
↓再度遠心（13000rpm、1分、室温）。
↓青いカラムを新しい1.5ccチューブにのせて、カラムのまん中にTEを50 μl入れる。
↓遠心（13000rpm、1分、室温）。
↓1.5ccチューブ内にサンプルが50 ml回収される。カラムはすてる。
DNAの定量（5 μlのサンプルをとって、95 μl TEとまぜる）。

 

Sequence

Sequence反応

• 0.1mg/ml DNAを1.5CC tubeに調整
• 1ml DNA + DW (OD-0.1)×10ml

PCR tube
0.1μg/ml DNA	1 μl (100ng)	×本数分用意し、8.8 μlずつ分注
DW	6.5 μl
Primer	1 μl
Enzyme mixture (ver.3)	1.5 μl	×本数分用意し、8.8 μlずつ分注
	10 μl

 

Primer

Forward(F)、reverse(R)、278(T3)、279(T7) → for TA vector
278(T3)、279(T7) → for pBluescript�U vector

PCR条件

プログラムabi→exp big
95℃になったら入れる
96℃ 1 min　┐
96℃ 10 sec │
50℃ 5 sec　├25 cycle
60℃ 4 min　┘
4℃ ∞
↓
-20℃保存可

 

Sequence反応後からSequenceまで

1.5cc tube
↓ add 15 ml DW
↓ add 65 ml 99.5% EtOH (R.T.のでよい)
↓ add PCR産物
↓ tube mixer、max、1分
↓ 静置、15分
↓ 遠心15000 rpm、20分、室温（ヒンジ側を外側にして）
↓ イエローチップを100 mlに設定し、ヒンジ側の反対側からEtOHを吸って除去
↓ add 250 ml 70% EtOH
↓ 遠心15000 rpm、5分、室温
↓ デカントでEtOHを除去
↓ キムタオルの上で逆さにする
↓ speed vac、4分＊チューブ立てに立ててアルミホイルで包んで-20℃保存可
↓ add 16 ml ホルムアミド（HiDiホルムアミド）
↓ tube mixer、max、1分
↓ IWAKIのヒートブロック、96℃、2分
↓ 急冷、on ice、5分
↓ サンプルを96ウェルにチャージ
イエローチップを18 mlに設定して処理
＊ sequenceには16の倍数分のサンプルが必要

サンプル数が16の倍数でない時は残りのウェルにホルムアミドのみを入れる。

 

Sequencerの使い方

1. パソコンの設定

1. DELL(sequencer用PC)電源ON
2. windows立ち上がる→Ctrl＋Alt+Delete→OK
3. タスクバーにOrbix Web Daemonがあることとを確認
4. sequencer ON 黄色→青色になるのを待つ
5. 3100 data collectionクリック
6. sequencerのtrayボタンを押す→トレイが左手前にくる
7. トレイを取り出し、（必ず左手前で停止してから取り出す）、どこからサンプルをチャージできるかを確認。トレイは取り出して外に置いておく
8. NEWをクリックし、データを入力してゆく
   plate name : 日付け入力 050321など
   application : sequencing
   plate type : 96 well
   →finish
9. サンプル名入力 H12-R、H12-T3など
   Dye set → Z
   Mobility File → DT3100 POP6 {BDv3} v1.mob
   BioLMS Project → 3100 Project 1
   Run Module → StdSeq 50 POP6 Defalt Module
   Analysis Module → BC-3100 SeqOffFtOff
   OK
   → pending plate recordテーブルに新しいplate recordが加わる

 

2. ゲルの交換

用意するもの

• プラスチック20ml容シリンジ（秤の下の箱の中に専用のがある）
• milliQ水を1リットル容ビーカーに800ml入れ、電子レンジ強で2分加熱
• ゲル、buffer

1. sequencerの左の扉を開く、レーザー部を開く
2. シリンジ2本、ブロック2つ、bufferの入った小ビンをはずす
3. レーザー部はすぐ閉じる
4. 2本のシリンジのゲルを押し出し、廃棄
5. シリンジの先、ブロックの周りをビーカー内で洗う
   （シリンジの中は洗ってはいけない）
6. ブロックの内部を洗う
   プラスチック20ml容シリンジを使って、ブロック内部にmilliQ水を通す
7. シリンジの先、ブロックの周りをキムタオルで拭う
8. ブロックの内部の水滴をエアーダスターを使用して飛ばす
9. シリンジにゲルを充填する
   大きいシリンジ → 約1 ml
   小さいシリンジ → 約150 ml
10. シリンジ2本、ブロック2つ、bufferの入った小ビンを元通り接続する

Tool → Change Polymer Wizard
ブロック内部のair抜きのところまで、指示に従いゲルのロットなどを記入

ブロック内部のair抜き
Change Polymer Wizardの指示に従う
↓ sequencer内のライトをつける
↓ 大きいシリンジを押し、大きいシリンジと小さいシリンジからの交点まで

ゲルを満たす
↓ 小さいシリンジを押し、大きいシリンジからのゲルと合わせる
↓ 大きいシリンジを押し、ゲルを下のブロックまで満たし、air抜きをする
↓ FINISHする

Tool → Perform Spatial Calibrationでキャリブレーションを2回行う
Detail checkして乱れがないか確認する

 

3. Bufferの交換

4つのトレイ、bufferの入った小ビンを取り出し、トレイ、トレイのフタ、小ビンをmilliQ水でよくすすぐ
↓ 3つのトレイ内の線のところまでmilliQ水を入れる
↓ トレイのフタの部分はキムタオル上でたたいて水滴をきる
↓ bufferを入れるトレイと小ビンの中の水滴はキムワイプで拭う
↓ 10×buffer（白いフタつきの入れ物）5 mlとmilliQ水 45 mlを50cc corning tubeに入れて混ぜる
↓ bufferを入れるトレイと小ビンにbufferを入れる
↓ 左手前にbufferが入ったトレイが来るようにsequencerにセットする

 

4. Sequence開始

Sequence反応後、EtOH沈殿したDNA
↓ add 16 ml ホルムアミド（HiDiホルムアミド）
↓ tube mixer、max、1分
↓ IWAKIのヒートブロック、96℃、2分
↓ 急冷、on ice、5分
↓ イエローチップを18 mlに設定サンプルを96ウェルにチャージ
　　　（泡ができないように注意）

トレイをsequencerに戻す→トレイAが認識される
↓ data (pending plate records)をクリックしてactiveにする
↓ トレイAをクリック
↓ linked plate recordsに認識される
↓ 緑の△印をクリックしてrun
↓ status viewで電圧をチェックする（70￣80mAくらいになるはず）
↓ ときどきrun viewでsequenceの様子をチェックする

5. sequenceの解析

PC画面でsequenceの終了を確認し、sequencerをOFFにする

デスクトップ
↓ sequence analysis
↓ add file
↓ applied bic
↓ 3100
↓ data extractor
↓ extracted runs
↓ 今日の日付けのfile
↓ add all
↓ finish ＊peak1 locationとstart pointを400にする
↓ Aのところの□をクリックして×印をつける
↓ start

デスクトップ
↓ short cut to extracted runs
↓ 今日の日付けのfile
新たにフォルダを作り、textのみを入れ、フロッピーディスクに保存

QIAGEN Maxi Plasmid Purification

前日

大腸菌をinoculate 50 ml culture×2本、24時間shake
大きいベクターの場合は50 ml culture×10本、12時間shake
↓

当日

高速遠心機、rotor 25番を冷却する。
P1（RNaseが入っていることを確認）
P3 on iceで冷やしておく
↓e.coli c.f.g. (大実験室のSwing rotor、3300rpm、20分)
↓p.p.t.に 10 ml P1を加え、vortex
　(1本にいれてresuspendしたら、もう1本に移してresusupend)
↓add 10 ml P2 フタをして転倒混和5回（vortexしない)
↓R.T.、5分
↓add 10 ml P3フタをして転倒混和10回
↓on ice、20分
↓c.f.g. 高速遠心機、rotor 25番 10,000 rpm、15分、4℃

ここからはガラスでなくディスポのピペットを使用する

QIAGEN-tip500を50 cc Falcon tubeにのせる
↓add 10 ml QBT（50 cc Falcon tubeのフタを上にのせる）（カラムの平衡化）
↓遠心した上清をカラムにデカントでのせる（吸着）
↓add 30 ml QC×2 （wash）
↓カラムを新しい50 cc Falcon tubeにのせる
↓add 15 ml QF (elution)
↓add 10.5 ml イソプロパノール（ここからはガラスのピペットでよい）
↓mix well
↓c.f.g. （rotor 25番 10,000 rpm、30分、4℃ 白いラベルを外に向けておく）
↓

p.p.t (=DNA) supはデカントですてる
↓add 5 ml 70% EtOH
↓c.f.g. (大実験室のSwing rotor、3300rpm、10分)
↓p.p.t.（上清をそっとデカント。無理ならブルーチップで吸う)
↓風乾 約1時間（Falcon tubeをたてて上にキムタオルをかぶせる）
↓

TE 500mlにresuspendし、1.5 cc microtubeに移す
O.D.測定

カルシウムコンピテントセルの作製

塩化カルシウムによって膜の透過性を変化させる方法

前日

LB 1リットル×2（2リットル容フラスコ×2）
高速遠心ローター30番用の遠沈管6本（アルミホイルでつつむ）をオートレーブ

XL1Blue を10ml LB(100ml容ボトル)にinoculate
↓37℃、shake、overnight

当日

高速遠心ローター30番用を冷やしておく

OD測定のblank用として、フラスコからLBを一部抜く(5mlくらい)
XL1Blue 10mlを各2リットルフラスコのLB1リットルへ
↓37℃、shake、1時間
↓OD₆₀₀測定
　ここからは約30分おきにOD₆₀₀を測定
　OD₆₀₀=0.4が最適（OD₆₀₀=0.5以上にならないように注意）
↓ここからは常にon iceまたは4℃で作業する。
　　　プラスチックのディスポのピペットを使用する。
↓OD₆₀₀=0.4になったら、高速遠心ローター30番で遠心、8000rpm、6分
↓p.p.t.を約400mlのbuffer A
　(10 mM PIPES pH7.0、60 mM CaCl₂、15% glycerol)にresuspend
　(ローター30番用遠沈管8分目くらい）
↓高速遠心ローター30番で遠心、3000rpm、6分
↓p.p.t.を約100mlのbuffer Aにresuspend（50cc corning tube 2本）
↓分注器、オートクレーブ済み1.5cc tube、液体窒素in大きい方の入れ物を用意
on iceで500ミクロずつ分注（1.5 cc tube約200本）、すぐに液体窒素で凍結し、-80℃で保存

フェノールのつくりかた

Phenol、 Crystals (Wako 160-12725 500g)
↓5-クロロ-8-ヒドロキシキノリンを0.5g加える。
↓DW、1M Tris-HCl (pH8.0) 共に滅菌したものを約100 mlずつ加える
　（デカントでよい、かなり適当）
↓37℃ water bathであたためてとかす
↓とけたら、室温にだす
↓2層になるので上清をpH試験紙でチェック。中性（pH7.0）になればよい。
　ならなかったら、さらにDWと1M Tris-HCl (pH8.0)を加える。
↓しばらく放置
↓上清をpH試験紙でチェックをくり返す
↓overnightで室温に静置
↓
cold roomで保存