Cortical neuron primary culture
用意するもの
- 初代培養一式（ピンセット、ハサミ、ガラスシャーレ、ビーカーはオートクレーブしておく。）
- 5 % Horse serum / 5 % FBS / DF medium + PS
- Serum free DF medium（dish洗い用）
- 0.25 % Tripsin（EDTAは入っていない。）
- 1 mg/ml DNase
- L15 medium
- Hanks solution
- 妊娠16日のラット
＊購入する場合は交配の都合上、培養可能な曜日が木、金、土、日に限られる。
前日までの準備
- 3.5 cm dishのPoly-L-lysineコート。（使用目的に応じて6cmでも可。）
手順
E16ラット（1腹分）。
- 実験室で胎児を取り出し、70 %エタノール中に沈める。培養室へ。（以降の作業は無菌的に行う。）
- すぐにCold PBSの入ったビーカーに移す。
- ガラスシャーレ上で胎児の全脳を取り出し、L 15の入ったガラスシャーレへ。（ガラスシャーレは氷上。）
- 全ての胎児の脳を取り終わったら、クリーンベンチ内に顕微鏡を持ち込む。
- 顕微鏡下で、大脳皮質をメスで切り取る。
- 髄膜をピンセットで取り除く。全体的に白っぽくなる。
- ピンセットで細かくする。（パスツールピペットで吸えるぐらいまで。）
- パスツールで吸って、Hanks solutionが10 ml入った50 mlチューブに移す。
50 mlチューブは氷上。 - 全ての皮質を取り終わったら、50 mlチューブの上清をピペットで取り除く。
- 沈殿に0.25 % Tripsinを3 mlと1 mg/ml DNaseを30 μl(final 10 μg／ml)加える。
- 1〜2分静置。
- 上清をピペットで取り除く。
- 再度、沈殿に0.25 % Tripsinを3 mlと1 mg/ml DNaseを30 μl(final 10 μg／ml)加える。
- 37℃で15 min incubate（この間にdishを洗っておく。DW X 3 + Serum free medium X 1）
- Horse serumを3 ml（Tripsinと等量）加えて、Tripsinを失活させる。
- 遠心。600 rpm, 5 min
- 上清はピペットで取り除く。＊沈殿はやわらかいので吸わないように注意する。ぎりぎりまで吸う必要はない。
- 5 % Horse serum / 5 % FBS / DF mediumを5 ml加えてピペッティング。10回。
- 10 mlのピペットの先にブルーチップをつけて更に10回ピペッティング。
- 1〜2分静置。
- 上清は新しい50 mlチューブに移す。－①
- 5 % Horse serum / 5 % FBS / DF mediumを5 ml加えて、10 mlのピペットの先にブルーチップをつけてピペッティング。10回。
- 1〜2分静置。
- 上清は①の50 mlチューブに移す。
- 5 % Horse serum / 5 % FBS / DF mediumを5 ml加えて、10 mlのピペットの先にブルーチップをつけてピペッティング。10回。
- 1〜2分静置。
- 上清は①の50 mlチューブに移す。
- レンズフィルターを新しい50 mlチューブの上にセットし、その上に10 mlのシリンジを取り付けて、フィルターにかける。
- 自然にぽたぽた落ちるのでそのまま静置。
- cell count（胎児10匹で1×108 cellsぐらいとれる。）
- 2×106 cells/3.5 cm dish
＊1×108 cellsとれれば3.5 cm dish 50枚分まける。 - 培養2日後からAra.Cをfinal 10 mM加える。
Stock solution
F12 medium
- 1リットルのオートクレーブしたミリQにF12粉末を溶かす。
- PH 7.4に合わせる。
- 30 mM Na2SeO3を2 ml加える。（final 60 nM）
- 1 M Hepes-NaOH (PH 7.4)を10 ml加える。
- フィルターにかけて、オートクレーブしたビンに入れて4℃保存。
DF medium
DMEMとF12を1：1で混合し、PSを1／100量加える。
Ara. C (Sigma C-3631, サイトシンアラビノサイド)
1 mM in DDW。使用時は100倍希釈して10 m M で使用する。
＊一旦、mediumで10倍に希釈したものを作製し、これをmediumの1／10量加える。