細胞培養法
- 培養室に入る時は外で着ていた白衣は脱ぐ。
- 培養室の中で手をよく洗う。特に大腸菌や酵母を扱ったあとは注意。
培地（Medium）
当研究室ではDMEM、MEM、F-12、Leibovitz's L-15、RPMI-1620などの培地を目的に応じて使用している。最も頻繁に使用するのはDMEM。
DMEM作成法
5L容のビーカーにミリQ水を5L入れる（スターラ−バーも入っていることを確認）。
↓ DMEM保存用500ml容ボトル11本をミリQ水で2回洗う。
↓ 上記をオートクレーブ。
培養室の奥のクリーンベンチ内でさますovernight。
以下はクリーンベンチ内で作業する。
↓ スターラ−をクリーンベンチ内に入れ、オートクレーブ済みミリQ水の入った5L容のビーカーをのせる。
↓ DMEM粉末（1L分×5）を入れる。ビンに残った粉末はビーカー内のミリQ水で洗い込む。
↓ 溶けたら、重曹（Sodium Bicarbonate）を18.5g量りとって入れる。
↓ 1N HClでpHを7.2に合わせる（約18 ml）。
↓ 500ml容フィルターで450mlずつfiltrationし、オートクレーブ済み500ml容ボトルに入れる。
低温室の棚に保管。
Fetal Clone (FC)
株化された培養細胞（COS-7、HeLa、MDCK、CHO、293T、Lなど）はこれで充分。
37℃で溶かして、50cc corning tubeに45mlずつ分注。培養室の冷凍庫に保管。
Fetal Bovine Serum (FBS)、Caf serum (CS)、Horse Serum (HS)
初代培養細胞に使用。
いずれも37℃で溶かした後、56℃で30分非働化処理を行う。
50cc corning tubeに45mlずつ分注。培養室の冷凍庫に保管。
Penicillin、Streptomycin（PS）、Non-essential amino acids (NEAA)
37℃で溶かして、15 cc corning tubeに10 mlずつ分注、培養室の冷凍庫に保存。いずれも100×なので100倍希釈して使用。
- このほか細胞によってはglutamateやsodium pyruvateを入れることもある。
- Glutamateは200mM stock。100倍希釈して使用。
培養液
- 培養液はベースとなる培地に、抗生物質と血清を添加して作成する。
- 一般的な培養液の組成は以下の通り。
COS-7、HeLa、MDCK、293T、L、NIH3T3
DMEM/10% FC or FBS/1% PS
BHK21
MEM/5% FC or FBS/1% PS
CHO
DMEM/10% FC or FBS/1% PS/2mM glutamate
作り方（500ml）
DMEM (500mlボトル入り)、FC or FBS 50ml、PS 5mlを37℃で溶かす。
| DMEM | 450 ml |
| FC or FBS | 50 ml |
| PS | 5 ml |
| 1M Hepes-NaOH (pH7.4) | 5 ml |
| 500 ml |
0.22μm filterでfiltration
細胞の解凍
準備：15cc tube、10cm or 6cm dish
起こす細胞に適したmediumを37℃のwater bathで温めておく。
↓ 15cc Corning tube にmediumを8 ml程入れておく。
↓ 台帳で目的の細胞保管場所を探す。
↓ 液体窒素で凍結保存されたscrew-cap tubeを取り出す。
↓ 37℃のwater bathで一気に解凍。
保存した時にcapがゆるんでいると破裂するので注意。
↓ おおよそ解凍できたら、手で握って解凍。
↓ 全量15cc Corning tubeに入れてsuspendし、遠心 1000回転、5分。
↓ Supをパスツールピペットで吸引。
↓ Mediumを10 ml加え、resuspendし、再度遠心 1000回転、5分。
↓ 細胞の量に応じた大きさのdishに蒔く。
↓ Incubator (37℃、5％CO2)へ入れる。
細胞の凍結保存
準備：Screw-cap付2cc容microtube(オレンジのキャップ)
10％DMSO/DMEM/(10％FBS)(1%PS)
↓ mediumをaspirateしPBSでwash。
↓ TEを加え、incubate、37℃、5分。
↓ mediumを加えて細胞を15cc tubeに回収し、遠心 1000rpm、RT、3分。
↓ 遠心している間にscrew-cap tubeを用意し、ラベルを記載。
日付け、（stableならコンストラクト名をフルネームで）、細胞名、継代数。
↓ Mediumをaspirateし、細胞を10％DMSO/DMEM/(10％FBS)(1%PS)
1mlでresuspendし、screw-cap tubeに入れる。
Capがゆるんでいると解凍したときに破裂するので、しっかりと閉める。
↓ キムタオルで包んでビニールテープでとめる。
↓ 上下逆さにならなように注意し、-80℃のフリーザーで凍結、over night。
液体窒素で凍結、台帳に記載。
ポイントは、保存する時はゆっくり凍結し、解凍するときは素早く。