ラット大脳分画
ガラス製品は使用しない。ピペットはディスポのプラスチックピペットを使用。
- 4 Rat Brains（fresh）を集める。小脳は除去。
５週齢くらいがよい。凍結したものは不可。 - 32 mlの0.32M sucrose/4mM Hepes-NaOH (pH 7.3)でhomogenize
detergent freeのホモゲナイザ－で600
rpm×10 strokes at 4℃
＊homogenate 1.5 ml保存 H=homogenate - 800×g 10 min 遠心してP１とS1にする。
50 PAアツチューブ R20A ローター（No. 46）2,600 rpm
＊ P１は少量のDWにresusupendしておく P1=nuclear fraction
＊ S1を1.0 ml保存 S1=crude synaptosomal fraction - S１を9200×g 15 min 遠心してP2とS2にする。
50 PAアツチューブ R20A ローター（No. 46）10,000 rpm
＊S2はそのままとっておく S2=cytosolic synaptosomal fraction - P2を32 mlの0.32M sucrose/4mM Hepes-NaOH (pH 7.3)にresuspend
- 10,200×g 15 min 遠心してP2'とS2'にする。
50 PAアツチューブ R20A ローター（No. 46）10,000 rpm
S2'は捨ててよい。 - P2'を6 mlの0.32M sucrose/4mM Hepes-NaOH (pH 7.3)にresuspend
一部(1.0 ml)をぬく P2'=crude synaptosomal pellet fraction
54 mlのice cold waterを加えて1,500 rpm×3 strokesでhomogenizeして、0.4 mlの1M Hepes-NaOH (pH 7.3)を加えて氷の上に30分置いておく。
APMSF 10 μg/ml 左記のようにプロテアーゼ阻害剤を加える。
Leupeptin 10 μg/ml
Pepstatin 10 μg/ml - 25,000×g 20 min 遠心してLP1とLS1にする。
50 PAアツチューブ R20A ローター（No. 46）20,000 rpm 20 min - LS1を165,000×g 2 hrs 遠心して、LP2を得る。
P50AT2 ローター36000 rpm 2 hrs
LP2=synaptosomal vesicle fraction - LP1を2 mlのwaterにresuspendする。
一部(0.5 ml)ぬく LP1=synaptosomal membrane fraction
22.4 mlの1.5 M sucroseと112mlの1M Hepes-NaOH (pH 7.3)を加えて全量を28 mlにメスアップ。40PAチューブ2本に14 mlずつ入れてそのうえに14 mlの0.8 M sucrose、4 mlの0.3 M sucroseを重層する。
SwingローターP28Sで19,000 rpm 150 min.
＊LP1はhomogenizeして保存しておく - 0.8 Mと1.2 Mの間をとる。これがSPM。
SPMに等量のDWを加えて小型超遠心150,000×g 30 min遠心。
AT5ローター 61,000 rpm 30 min
pptを2 mlの50 mM Hepes-NaOH (pH 7.3)にresuspend、
sonication 10秒×6回。
半分をSPMとしてとっておく SPM=synapticplasma membrane fraction - SPMの半分にTriton X-100をfinal 0.5 % (w/v)になるように加えて15 min.
on ice - 小型超遠心で35,000×g 20 min遠心
- pptを1 mlの50 mM Hepes-NaOH (pH 7.3)にresuspend。
Sonicationし、0.5 mlを保存 PSD1-p.p.t.
＊supはPSD1のsupとして保存 PSD1- sup - 残りの0.5 mlにTriton X-100をfinal 1.0 %(w/v)になるように加えて15 min
on ice - 小型超遠心で201,800×g 1 hr 遠心。
Pptを0.5 mlの50 mM Hepes-NaOH (pH 7.3)にresuspendし、sonaicate。
PSD2-p.p.t.
＊supはPSD2のsupとして保存 PSD2-sup
分画の並べ方は、
①H、②P1、③S2、④S1、⑤P2'、⑥LP2、⑦LP1、⑧SPM、⑨PSD1-sup、⑩PSD1-ppt、⑪PSD2-sup、⑫PSD2-pptとなる。