DEAE-Dextran dependent transfection for COS-7 cells
手順 (10cm dish時)
前日にCOS-7を0.8〜1×106cells/10cm dish、3×105cells/6cm dish、1.5×105cells/3.5cm
dishまき、transfectionに用いるDNA量を計算しておく
↓
当日
準備：10% FC 1%PS in DMEM、20% glycerol in DMEMを37℃に温めておく
細胞がdish内に7〜8割程度いることを確認
DEAE-Dextran溶液の作製
| 2×TBS | 1.1ml/plate |
| DW | 0.84ml/plate |
| DEAE-Dextran | 0.22ml/plate |
| 合計 | 2.16ml/plate |
corning tubeを用意し、DEAE-Dextran溶液を分注
↓ DNAサンプルを15〜30μg加え、よくピペッティング
使うDNAサンプルが数種類あっても全量で30μgまでが限界
↓ plateを取り出し、medium除去して4ml PBSでリンス1回
↓ PBS除去後plateにDEAE-Dextran-DNA溶液をピペッティングを加える
↓ 37℃、5%CO2 incubator、30分
15分で一度軽くゆすり、向きを変える（インキュベータ−が傾いているから）
この間に、
10mMクロロキン(5.15mg/ml)溶液を作製
- クロロキン粉末を滅菌水で5.15mg/mlになるように混ぜ、0.22μm
- フィルターで滅菌（＝10mMクロロキン）
- これをmediumで100倍希釈し、
- 0.1mMクロロキン/mediumを4×(サンプル数+1) ml分作製
↓ plateのDEAE-Dextran溶液を除去し、4mlの0.1mMクロロキンmediumを加える
↓ 37℃、5%CO2 incubator、3時間
↓ plateの状態を確認、0.1mMクロロキンmediumを除去し、4ml PBSでリンス
↓ 20% glycerol in DMEMを2mlゆっくり加えて、正確に2minおく
↓ 20% glycerolを除去し、PBSでリンス×2回
10% FC 1%PS in DMEMを8ml加える
37℃、5%CO2 incubator、40〜72時間で発現が確認できる
細胞の回収
PBSは自家製の10×PBSをmilliQ水で10倍希釈したものを使用
10 cm dish
↓ 4ml PBSでwash×2回
↓ 4ml PBS/plateで細胞をはがし、コーニングチューブへ回収
↓ 4ml PBS/plateで再度洗い、回収
↓ 遠心 2,000rpm 5min 4℃
p.p.t. （-20℃で保存可）
Transfection using Lipofectamine 2000
Lipofectamin 2000 Reagent (Invitrogen, Cat. No.: 11668-019)
手順 (3.5cm dish、HeLaの場合)
前日
HeLa細胞を2.5×105cells/3.5cm dishまく
当日
用意：DMEM/10% FBS/PSなしのmedium、Opti-MEMを37℃であたためておく。
Transfection 1時間前に3.5cm dishをPBS
2mlでwashし、PSなしのmediumに置き換える。
＊前日に細胞をまく時にPSなしのmediumでまいてもよい。
↓
1.5 cc tube A、Bを用意。
Tube A：Opti-MEM 250μl＋Lipofectamine 2000 reagent 5μl→vortexし、静置5分
Tube B : Opti-MEM
250μl＋DNA 2.5μg
↓ Tube BのDNAをTube Aに加え、ピペッティング
↓
室温で20分静置
↓ dishに全量（約500μl）ポタポタとたらす
翌日には発現が確認できる
Transfection using Effectene Transfection Reagent
- QIAGENのEffectene Transfection Reagentのキットを使用。
- 培養室の冷蔵庫から出し、室温にもどしておく。
MDCK細胞の場合
前日に2×105cells /3.5 cm dishまいておく。Mediumは1.5 ml
当日
1.5 ccチューブAにDNA, buffer EC, enhancerをまぜる
DNA : enhancer = 1 : 8であることが重要
| buffer EC | 150ml |
| DNA | 1 mg |
| enhancer | 8 ml |
↓ ブルーチップでピペッティング
↓ 室温で5分静置
↓ effectene 20ml 加える
↓ ブルーチップでピペッティング×5回
↓ 室温で10分静置
この間にdishをPBSで一回洗い、新しいmedium 1.5 mlに置き換えておく
↓ mediumを加えtotal 500mlにする。ピペッティング×2回
全量dishに加える、dropwise
↓
翌日medium交換する。
Transfection (Calcium-phosphate method)
- Promegaのキットを使用する。培養室の冷蔵庫から出し、室温にもどしておく。
293T細胞の場合
前日に2×105cells /3.5 cm dishまいておく。Mediumは1.5 ml
1.5 ccチューブAにDNA, sterile
water, CaCl2をまぜる
| DNA | 1〜2 μg |
| Sterile water | |
| CaCl2 | 12 μl |
| 100 μl |
1.5ccチューブBに2×HBSを100 ml入れる
↓ チューブBをvortex mixerでvortexしながら、チューブAのDNA溶液を加える、dropwise
↓ 室温で30分静置
↓ かるくvortex
↓ dishに加える、dropwise
↓
翌日poly-L-lysine coatした18mm coverslipをいれた3.5 cm dishにまき直す。