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実験プロトコル

細胞染色

細胞染色用PBS：市販のPBS粉末（1袋1リットル分）をmilliQ水でとかしたもの

<1> 細胞の固定、permeabilize、blocking


<ホルマリン固定>

3.7％ホルマリン溶液：
ホルムアルデヒド(36〜38％)をPBS(細胞染色用＊以下同様)で10倍希釈

3.5 cm dishの場合
　↓　 PBS 1.5ml/dishでwash×2回
　↓　 3.7％ホルマリン/PBS 1.5ml/dish、室温、15分
　↓　 ホルマリンは回収して廃液入れに捨てる
dishをPBS 1.5ml/dishでwash×2回
　↓　 50mM glycine/PBS 1.5ml／dish、室温、30分（アルデヒド基をブロック）
＊この状態で2、3日4℃で保存可.
　↓　 PBS 1.5ml/dishでwash×2回

<メタノール固定>

　↓　 PBS 1.5ml/dishでwash×2回
　↓　 cold メタノール（-20℃）1.5ml/dish、-20℃、15分
　↓　 dishをPBS 1.5ml/dishでwash×2回
　↓　 Permeabilizeするとき、
0.2％ TX‐100/PBSを1.5ml/dish加える。室温、15分
Bovine Serum Albumin (BSA) を冷蔵庫から出し、室温にしておく
この間に1％BSA/PBSと1％BSA/0.1％TX‐100/PBSを作製
Permeabilizeしないときは、この過程をとばして次のblockingの過程に入る
　↓　 dishをPBSでwash ×3回
　↓　 Blocking
Permeabilizeしたとき、
1％BSA/PBSを1.5ml/dish添加、室温、30分
Permeabilizeしないときは、blockingをきつくする
3％BSA/PBSを1.5ml/dish添加、室温、30分.
　↓　 PBSでリンス一回

 

<2> 1次抗体

　↓　 1.5cc tubeに各抗体＋1％BSA/0.1％TX‐100/PBS
（50μl/カバースリップ）
Permeabilizeしないときは、1％BSA/PBS（TX‐100は入れない）。
　↓　 15cm dishのフタにパラフィルムを敷き、その上に抗体溶液を垂らし、カバースリップを乗せる.
　↓　 水で濡らしたキムワイプを入れて加湿をしておく
4℃、overnight

 

<3> 2次抗体 可能な限り遮蔽して行う

　↓　 1.5cc tubeに各2次抗体＋1％BSA/0.1％TX‐100/PBS
（2次抗体は1:200で使用、50μl/カバースリップ）抗体は遮蔽しておく
Permeabilizeしないときは、1％BSA/PBS
　↓　 混合した抗体の溶液を遠心15000rpm、10分、4℃
　↓　 12wellのdishに0.1％TX‐100/PBSを1.5ml/dish入れ、カバースリップを15cm dishから細胞面を上にして移す. PermeabilizeしないときはPBSのみ（TX‐100は入れない）。
　↓　 室温、5分 ×3回
　↓　 15cm dishにパラフィルムを敷き、その上に抗体溶液を垂らし、カバースリップを乗せる.
室温、2時間 or 4℃、4時間 （加湿をしておく）
　↓　 12wellのdishに0.1％TX‐100/PBSを1.5ml/dish入れ、カバースリップを15cm dishから細胞面を上にして移す. PermeabilizeしないときはPBSのみ（TX‐100は入れない）。
　↓　 室温、5分×3回
　↓　 PBS 1.5ml/dish、室温、5分

 

<4> 包埋

　↓　 蛍光染色用のカバーガラス上に30μl 95％glycerol/5％PBSを垂らし, カバースリップの水気を充分にきり, 細胞接着面を下にして乗せる.＊気泡が入らないように注意.
　↓　 キムタオルの間にはさみ、上からチューブ立てなど均一に力のかかるものでしっかり押す.
　↓　 透明マニキュアでカバースリップのまわりを封印して乾燥を防ぐ.
　↓　 黒い箱など遮蔽できるものに入れて冷蔵庫保存する.

TranswellでのMDCK細胞の培養、染色

(Costar 3413 : 6.5mm Transwell, Polycarbonate Membrane, 24well size）

<培養>

　↓　 トランスウェルのフィルター上に生えている細胞は顕微鏡で見えない。
そこで、24wellサイズのトランスウェルのフィルターの面積は96ウェルプレートとほぼ同じ(0.33cm2)なので、96ウェルにも同じ細胞数まいて観察用とする。
コンフルエント（島ではなくウェルの底面全体が細胞におおわれている状態）になってからさらに3〜4日培養。
染色は固定後50 mMグリシン／PBSの状態で4℃保存できるので、コンフルエントになってから3日後、4日後、5日後とそれぞれ50 mMグリシン／PBSの状態にしておいて、一度に染色するのも可。
　↓　 新しい24wellにmediumを600 ml入れる。
24wellサイズのトランスウェルをピンセットで無菌的に取り出し、mediumを入れた24wellに入れる。
細胞を1x106 cell / mlになるように調整して、upper chamber へ100 ml（1x105cells）。
（イエローチップで、フィルターを傷つけないように、トランスウェルの壁面をつたわらせて入れる。）同様に96wellにも100 mlまく（観察用）。
　↓　 残りのトランスウェルはビニールテープで封をし、アルミホイルに包んで、クリーンベンチの中に入れておく。

<染色>

PBSリンス2回
　↓　3.7 %ホルムアルデヒド／PBS 室温、15分
　↓　50 mMグリシン／PBS 室温、30分
　↓　PBS wash 5分×2回
　↓　0.2% TritonX-100／PBS 室温、15分
　↓　PBS wash 5分×3回
　↓　1% BSA／PBS 室温、30分
　↓　一次抗体／1% BSA／0.1% TritonX-100／PBS 4℃、overnight
　↓　0.1% TritonX-100／PBS wash 5分×3回
　↓　二次抗体／1% BSA／0.1% TritonX-100／PBS 室温、2〜3時間

（二次抗体溶液を15000rpmで15分遠心するのを忘れずに）
　↓　0.1% TritonX-100／PBS wash 5分×3回
　↓　PBS wash 5分×1回
　↓　包埋

トランスウェルフィルターを乾かさないように注意。
PBS wash、固定、グリシンブロック、permeabilize、BSAブロッキングは使いまわしの24well内で行う。 (24well内にあらかじめ固定液やPBS wash 3回分とか入れておく。トランスウェルをピンセットで持ち上げ、フィルター内の液をイエローチップで捨て、次の液の入ったウェルに移す。トランスウェルの中にイエローチップでそっと液を入れる。アスピレーターは使わないほうが無難。)
一次抗体とインキュベートするときは、12ウェル内にパラフィルムを敷き抗体溶液を少量たらし、その上にトランスウェルを置き、トランスウェル内にも抗体溶液を添加する。乾燥対策を忘れずに（となりのウェルにミリQ水をいれておく、12ウェルのフタをしパラフィルムでシールする）。
washは24well内で。
二次抗体とインキュベートするときもパラフィルムの上で行う。乾燥対策。

<包埋>

  1. スライドガラスに95% glycerol / 5% PBSを少量たらしておく。
  2. フィルターをトランスウェルからくりぬく。
  3. フィルターを底からウェルの丸型に沿ってカッター（ディスポのでよい）で切り抜く。
  4. この時全部くりぬかずにちょっと残しておいて、ピンセットでフィルターをつかんで引きちぎるようにはずす。
  5. そのまま細胞面が上（カバーガラスの染色の時とは逆なので注意）になるように、フィルターをスライドガラスへ。
  6. フィルターの上にさらに95% glycerol / 5% PBSを少量たらす。
  7. カバーガラスで蓋をし（airを入れないように）、マニキュアで封入する。
  8. したがって、プレパラートはスライドガラス、グリセロール、フィルター（細胞面上）、グリセロール、カバーガラス、となる。
  9. *観察のとき、apical面とbasal面が通常と上下が逆になることに注意。

細胞染色用poly-L-Lysine coated coverslipの準備

poly-L-Lysine hydrobromide（培養室の冷凍庫）（Sigma P-2636）
1M Borate buffer pH 8.5（培養室の冷蔵庫）
  • 1.24g boric acid
  • 1.9g borax (sodium borite)
  • 400 ml milliQ水→オートクレーブ
　↓　 0.1％ poly-L-Lysine / 0.1M Borate buffer pH 8.5の作製.
　↓　 Poly-L-Lysineを冷凍庫から出し室温に10min.。
　↓　 poly-L-Lysineを0.1M Borate buffer pH 8.5で溶解し1mg/1cc＝0.1％にする。
　↓　 よくピペッティングすること。溶けたと思ってからさらに10回はピペッティング。
　↓　 溶液を0.22μmのフィルターに通して滅菌。
　↓　 6cm dishにカバースリップ（硝酸処理後、水洗し、180℃、4hrs乾熱滅菌したもの）を専用のピンセットを火で炙って並べる。6cm dishに5枚のカバースリップが並べられる。
　↓　 0.1％poly-L-Lysine / 0.1M Borate pH 8.5を3ml。
　↓　 アルミホイルをかけて、クリ−ンベンチ内でover night。
 
　↓　 カバースリップを6cm dishに並べたままDWで3回、mediumで1回洗う。
　↓　 3.5 cm dishに入れて、細胞をまく。