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実験プロトコル

海馬神経初代培養法(G. Banker Methodを改変)

用意するもの

  • 初代培養一式(ピンセット、ハサミ、ガラスシャーレ、ビーカーはオートクレーブしておく。)
  • 10 % Horse serum / MEM
  • 0.25 % Tripsin(EDTAは入っていない。)
  • L15 medium
  • Hanks solution
  • N2-MEM

前日までの準備

  • パラフィンの足つけ。
  • カバーガラスのPoly-L-lysineコート。
    *カバーガラスは硝酸処理をして乾熱滅菌したものを使用する。カバーガラスが汚いときれいなデータが取れないので注意する。
  • 12 wellにグリアをまく。

手順

E18ラット(1腹分)
 ↓ 実験室で胎児を取り出し、70 %エタノール中に沈める。

培養室へ。(以降の作業は無菌的に行う。)
 ↓ すぐにCold PBSの入ったビーカーに移す。
 ↓ ガラスシャーレ上で胎児の全脳を取り出し、L 15の入ったガラスシャーレへ。

(ガラスシャーレは氷上。)
 ↓ 全ての胎児の脳を取り終わったら、クリーンベンチ内に顕微鏡を持ち込む。
 ↓ 顕微鏡下で、海馬を取る。
 ↓ パスツールピペットで海馬を吸ってHanksが5 ml入った15 mlチューブへ。

(15 mlチューブは氷上。)

*余分な膜などを一緒に吸わないように注意する。
 ↓ 全ての海馬を取り終わったら上清をピペットで吸う。(海馬を吸わないように!)
 ↓ 0.25 % Tripsinを5 ml加えて37℃で15 min incubate
 ↓ 上清をピペットで吸う。

*沈殿はやわらかいので吸わないように注意する。
 ↓ Hanks solutionを5 ml加える。(沈殿が浮く。)−@
 ↓ 1〜2分静置。(海馬が沈むまで。)−A
 ↓ @、Aを3回繰り返し、Tripsinを除く。
 ↓ Hanks solutionを5 ml加えて、5 mlのピペットの先にブルーチップをつけて勢い良くピペッティング。目安10回。10回ピペッティングしてまだ塊が残っていたらあと2回。

*ピペッティングは、やり過ぎると良くないので12回ぐらいまでにしておく。
 ↓ cell count(胎児10匹で1×106 cellsぐらいとれる。)
 ↓ 5×104 cells/6 cm dish

*1×106 cellsとれれば6 cm dish 20枚分まけるので12 wellにすると10枚分まける。
 ↓ 翌日、グリア細胞のまいてある12 wellプレートのmediumを吸ってN2-MEMを1 ml/well入れる。
 ↓ 1wellに1枚ずつ神経細胞の接着したカバーガラスをひっくり返して(パラフィン面を下にして)入れる。
 ↓ 以降medium交換はしてはいけない。
 ↓ 神経細胞とグリア細胞の状態が良ければ、3週間〜1ヶ月間培養できる。

 

Stock Solutions for N2

N2 supplement (10X)

1.0 ml Insulin Stock
1.0 ml Progesterone Stock
1.0 ml Putrescine stock
1.0 ml Selenium Stock
100 mg Transferrin (Sigma #T-2252)
96.0 ml MEM

Filter sterilize. Store frozen in 10.0 ml aliquots.

Ovalbumin, 1 % (10X)

1.0 g Ovalbumin (Sigma #A-5503)

100 ml H2O

Do not stir or filter fast, or albumin will denature. Prefilter with 0.44 mm filter, then sterilize with 0.22 mm filter and frozen in 10 ml aliquots.

Pyruvate, 100 mM (100X)

1.1 g pyruvate (Sigma #P-2256; MW:110.0)
100.0 ml H2O

Filter sterilize and store at 4 ℃. Shelf life: 3 months.

Stock Solutions for N2 supplement

  1. Insulin-1000X (final conc. In N2 is 5 μg/ml)
    50.0 mg Insulin (Sigma #I-5500)
    10.0 ml 0.01N HCl
    (1N HCl = 8.6 ml conc. HCl/100 ml H2O ; then dilute this 1:100)
  2. Progesterone-1000X (final conc. In N2 is 20 nM)
    63.0 mg Progesterone (Sigma #P-01301; MW 314.5)
    100.0 ml Absolute Ethanol
    This gives a 100,000X solution. Dilute this 1:100 with H2O to make the 1000X stock solution.
  3. Putrescine-1000X (final conc. In N2 is 100 uM)
    161.0 mg Putrescine (Sigma #P-7505; MW 161.1)
  4. selenium Dioxide-1000X (final conc. In N2 is 30 nM)
    33.0 mg Selenium Dioxide (Sigma #S-9379; FW 110.0)
    100.0 ml H2O

This gives a 100,000X solution. Dilute this 1:100 to make the 1000X stock solution.
Filter sterilize solitions 1 to 4. Freeze 10 ml of each in aliquots of 1 ml.

 

Other Solutions

Borate Buffer (0.1 M-PH 8.5)

1.24 g Boric Acid
1.90 g Borax (Sodium Borate)
400 ml H2O

This should give a PH 8.5. Autoclave and store in refrigerator.

Poly-L-lysine

Dissolve Poly-L-lysine (Sigma #P-2636) at 0.5 mg/ml in borate buffer.
Filter sterilize. Prepare the Poly-L-lysine solution fresh each time.