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実験プロトコル

細胞表面ビオチン化

Cell Surface Biotinylation　（for MDCK cells）

用意するもの

  • 12mm Transwell, polycarbonate Membrane (Costar Cat. No. 3401)
  • PBS-CM : 1 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2 in PBS
  • Sulfo-NHS-biotin : EZ-Link Sulfo-NHS-biotin (Pierce Prod. No. 21217)
    stock solution (200 mg/ml in DMSO, -20℃保存)
    使用時に0.5 mg/ml (stockを400倍希釈) in PBS-CMにし、すぐに使用。
  • 50 mM NH4Cl in PBS
  1. 細胞（MDCK）を2×106 cells / Transwell upper chamberにまく
    upper chamberに 0.7 ml、lower chamberに 1.5 mlのmedium
    transwellは顕微鏡で観察できない。そこで、細胞の状態を観察するために24 well plateにもまいておく。
    12mm Transwell upper chamberのgrowth areaは１cm２、24 well plateのgrowth areaは１.88cm２なので
    2×106 cells×1.88 = 3.76×106 cellsまいて観察用とする
  2. ４〜５days (confluent monolayerになるまで)
    cold PBS-CMでリンス2回(membrane filterを傷つけないように注意)
  3. freshly prepared Sulfo-NHS-biotin in PBS-CM (0.5 mg/ml)を加える
    　apical側からビオチン化
    　　upper chamberに 0.7 mlの0.5 mg/ml Sulfo-NHS-biotin in PBS-CM
    　　lower chamberに 1.5 ml のPBS-CM
    　basal側からビオチン化
    　　upper chamberに 0.7 mlのPBS-CM
    　　lower chamberに1.5 mlの0.5 mg/ml Sulfo-NHS-biotin in PBS-CM
  4. 30 min on shaker in cold room
  5. upper chamber, lower chamberの溶液を捨て、新たな溶液に交換。
    　（ブルーチップで行う。membrane filterを傷つけないように注意。）
  6. 30 min on shaker in cold room
  7. cold PBS-CMでリンス2回
  8. Quench reaction
    Biotin solutionを除去し、1 ml 50 mM NH4Cl in PBSを加える
  9. 10 min in cold room
  10. cold PBS-CMでリンス2回
  11. membrane filterをscalpelで切り出し、-20℃保存、もしくはすぐにextraction of biotinylated proteins にうつる

 

Extraction of biotinylated proteins

用意するもの

  • Avidin-beads, immobilized on cross-linked 6% beaded agarose (Sigma A-9207)
  • PBSでwashして50% (v/v) avidin-beads in PBSの状態で４℃分注保存
  • Lysis buffer : 1% Triton X-100, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl
  • Wash buffer : 0.5% Triton X-100, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl
  1. 切り出したmembrane filterを1.5 cc tubeに入れる
  2. add 200￣500 ml lysis buffer
  3. membrane ごとsonication 10 sec×6
  4. membrane filterを取り除いて、
  5. c.f.g 100,000×g (日立小型超遠心機、50,000 rpm), 15 min. , 4℃
  6. supernatant → origin 50 ml 保存
    残り150 ml
  7. add 20 ml 50% avidin-beads in PBS
  8. rotate on rotator in cold room for 3hrs 〜 overnight
  9. c.f.g 1500 rpm, 3 min, 4℃
  10. 上清を捨て、ビーズにlysis bufferを400 ml加える
  11. 9.〜10.×３回くり返す
  12. c.f.g 1500 rpm, 3 min, 4℃
  13. 上清を捨て、ビーズにlysis bufferを50μl 加える
    3×laemlli bufferを25 μl 加える
  14. SDS-PAGE
    transfer
    Western blot
    Control としてanti-E-cadherin (Transduction mouse) 1:1000でblotする。