研究内容・業績
大学院生募集
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大学院生募集
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| 担当者 | 医局長 石橋 哲（いしばし さとる） TEL：03-5803-5234 (医局) FAX：03-5803-0169 E-mail：t-ishibashi.nuro@tmd.ac.jp |
研究内容
当教室の研究テーマは多岐にわたっているが、その一部を紹介する。
- 神経変性疾患、特に遺伝性脊髄小脳変性症の原因の同定と病態解明・治療法開発のため研究
- RNA干渉(RNAi)を用いた神経疾患の遺伝子治療 renew
- (A) 筋萎縮性側索硬化症の遺伝子治療
- (B) いかなる遺伝子変異に対しても変異アレル異的な遺伝子発現抑制方法の開発
- (C) ビタミンEを用いた新規siRNAベクターの開発
- (D) アデノ随伴ウイルスベクターを用いた家族性アミロイドニューロパチーの遺伝子治療
- (E) 脳血管内皮細胞（脳血液関門）のRNA干渉による制御
- (F) C型肝炎の遺伝子治療
- ビタミンE単独欠乏性運動失調症の原因遺伝子α-tocopherol transfer protein (αTTP)の発見と発症機序の研究 renew
- 免疫性神経疾患における血液脳関門・血液神経関門の破綻メカニズムの解析とその防止を目的とした分子細胞学的研究
- 幹細胞を利用した難治性神経疾患に対する再生治療法開発
- 認知症の病因解明と治療法の開発 renew
- 免疫性神経疾患の新たな治療法の開発
- 脳・神経生理機能の解析による神経疾患の病態生理解明および新しい診断法の開発
- 神経・筋疾患の病理学的研究 new
(1) 神経変性疾患、特に遺伝性脊髄小脳変性症の原因の同定と病態解明・治療法開発のため研究
当教室において、日本人に比較的多く見られるHolmes型遺伝性皮質性小脳失調症の遺伝子座を同定し、それがSCA6であることを明らかにした。また、もう一群の関連遺伝子の同定にも成功した。分子生物学的・電気生理学的手技を駆使してこの2つの疾患の病態解明に取り組んでいる。さらに、疾患遺伝子を導入した培養細胞でカルシウムチャネル機能の異常を初めて明らかにし、モデル動物の作製を手がけ、治療法開発へむけて努力している。
脊髄小脳失調症6型(SCA6)患者脳におけるα1Aカルシウムチャネル蛋白の免疫組織化学。SCA6はα1Aカルシウムチャネル遺伝子内のCAGrepeatが異常に伸長するために発病するが，その病態の一つとして，図の小脳Purkinje細胞に見られるように，変異α1Aカルシウムチャネルタンパクが凝集していることが関与していると考えられている。
(2) RNA干渉（RNAi）を用いた神経疾患の遺伝子治療の試み
RNA 干渉（RNA interference）は2本鎖RNAによって配列特異的に遺伝子の発現が抑制される現象で、いかなる標的遺伝子に対しても、特異性高くかつ高効率に発現抑制が可能で、2006年のノーベル医学生理学賞に選ばれました。我々はRNA干渉の臨床応用をその開発当初より精力的に研究しており、特に神経変性疾患やC型肝炎を対象とした遺伝子治療の研究に以下のような研究実績を上げ、その基礎技術の特許申請を行っている。これらの業績は朝日新聞、読売新聞、日本経済新聞などの一般誌でも繰り返し紹介されている。
（A) 筋萎縮性側索硬化症の遺伝子治療
（B) いかなる遺伝子変異に対しても変異アレル異的な遺伝子発現抑制方法の開発
（C) ビタミンEを用いた新規siRNAベクターの開発
（D) アデノ随伴ウイルスベクターを用いた家族性アミロイドニューロパチーの遺伝子治療
（E) 脳血管内皮細胞（脳血液関門）のRNA干渉による制御
（F) C型肝炎の遺伝子治療
家族性筋萎縮性側索硬化症など常染色体優性神経変性疾患の機序はgain of toxic functionと考えられて、このような疾患では、変異したタンパクの発現を抑制すれば、疾患の発症、進行を防止することが期待でる。我々はsiRNAトランスジェニックマウスを用いてsiRNAでSOD変異によるALSの発 症を大幅に遅延させることに成功し（図）、siRNAで常染色体優性遺伝性神経変性疾患が治療可能であることを示した。
（B）いかなる変異に対しても変異アレル特異的な遺伝子発現抑制方法の開発
常染色体優性遺伝疾患のRNA干渉を用いた遺伝子治療は、変異アリルの発現抑制により根本的な治療法となる可能性があるが、同時に正常アリルの発現抑制は新たな症状をきたす可能性が高い。したがって、常染色体優性遺伝疾患の治療には、正常アリルの発現を損わずに、変異アリルの発現のみを抑制することが望ましい。しかし，変異アレル特異的なsiRNAは，そのデザインが変異部位に限定されるため，必ずしもmRNA切断活性が高いとは限らないという限界がある。
そこで，我々はいかなる遺伝子変異に対しても変異アレル特異的遺伝子発現抑制が可能となるRNAi法を考案した。まず，変異部位に限らずmRNA全長から最も切断活性が高いターゲットサイトを選択し，siRNAを作製する。ただ，これでは野生型タンパクの発現も損なわれてしまうため，siRNAが切断できないようデザインしたcDNAを発現させて野生型タンパクを補う。一つのアミノ酸をコードするRNA配列が複数存在することを利用し，異なったcDNA配列で発現するアミノ酸が変わらないようにデザインした。実際に我々は，siRNAのデザインが困難な，繰り返し配列の長さの変異であるポリグルタミン病の1つ脊髄小脳失調症6型を対象に，in vitroの系でその有効性を証明し（上図）、現在in vivoでの本方法の有効性を立証中である。
核酸医薬として化学合成したsiRNAを用いた遺伝子治療では、標的細胞までのデリバリーが最大の問題点とされる。従来のカチオニックベクターでは、物理的に細胞膜を通過させようとしていることから、異物として認識され、自然免疫受容体の活性化など免疫応答を引き起こす問題があった。そこで生体の生理学的代謝経路を使う方法としてビタミンEベクターを考案した。想定される細胞内への導入システムを右図に示す。リポプロテインに取り込まれたVE-siRNAは受容体介在性エンドサイトーシスで細胞内に導入され、取り込まれたVE-siRNAは細胞質内のDicerにより認識されビタミンE結合端が切断されて、21merの成熟siRNAとなり標的遺伝子の抑制をする。
VE-siRNAベクターの導入機序
Cy3で蛍光標識されたVE-siRNAを尾静脈から全身投与すると、肝細胞への効率的な導入が確認され（右図A、赤）、肝組織のノザンブロットでは21merにプロセスされた成熟siRNAが確認された（右図B）。このビタミンEベクターの有効性は国内外の他のsiRNAべクターより優れており、しかも、内因性の経路を用いるため毒性が全くなくインターフェロンを含む免疫応答などの副作用も皆無であった。（米国特許出願済、2007年）
この戦略を中枢神経系に応用することにより大脳皮質（特に海馬）や基底核など広範囲の神経細胞およびグリアにsiRNAが導入された。現在、アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療法として有望と考え積極的に研究している。
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（赤：Cy3=siRNA、緑：MAP2=神経細胞体、青：DAPI=核） |
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（D）アデノ随伴ウイルスベクターを用いた家族性アミロイドニューロパチーの遺伝子治療
家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)は肝臓で産生される変異transthyretin(TTR)が末梢神経に沈着して発症する常染色体優性遺伝形式を示す神経難病だが、肝臓移植で疾患の治療が可能であることは確立しており、変異TTRをターゲットとするsiRNAが肝臓にデリバリーできれば根本治療になりうる。長期間にわたる持続的な遺伝子発現抑制にはshort hairpin RNA(shRNA)発現ウイルスベクターが適しており、特にアデノ随伴ウイルス（AAV）8は肝臓への導入効率が高く、変異TTRを標的としたAAV8を用いた遺伝子治療を試みた。shRNA発現ウイルスベクターには近年miRNAの成熟障害の副作用が指摘されているが、我々は発現コンストラクトとウイルス量の調整でその副作用を回避した。さらにV30M の塩基変異を特異的に認識するsiRNAをデザインして、FAPのモデルマウスであるV30M TTRトランスジェニックマウスを用いて1回のTTR shRNA発現AAV8の静脈注射で変異TTRを2カ月抑制することに成功した（図）。現在、サルを用いてその有効性・安全性を立証中であり、ヒトへの臨床応用を検討している。
脳血管内皮は神経疾患の中でも、脳梗塞などの脳虚血や多発性硬化症などの神経免疫疾患やアルツハイマー病において、その病態形成に重要な働きをしている。したがって、その内因性遺伝子の発現をsiRNAで抑制することができればこれら疾患の遺伝子治療の道が開ける可能性が高い。我々はsiRNAを高圧静脈注入法を用いて脳血管内皮に導入によりBBB輸送タンパクをノックダウンし、基質薬物の脳内からの排出を有効に抑制することに成功した（東北大学の寺崎哲也教授の開発したBrain Efflux Index法による定量）。さらに最近、我々の開発したビタミンEを用いた新規のデリバリー方法を応用して、通常の静脈注射により脳血管内皮細胞へのsiRNA導入に有望な結果を得て、脳梗塞やアルツハイマー病をターゲットとして研究を進めている。
1）すべてのC型肝炎ウイルスの遺伝子型に有効なsiRNA配列を特許申請している：
HCVは1本鎖RNAウイルスでproof readingの機能がなく、そのcoding sequenceは高率に変異が入って（実際の臨床でインターフェロンが効く例と効かない例がでるのはこの為）、siRNAが効かなくなる。HCVゲノム上唯一保存性の高い（99.8%） 5'IRESの部分はRNAの2次構造がタイトで、siRNAのデザインが非常に困難であるが、我々は独自のsiRNAのサイトを選択するバッテリーを用いて、欧米の報告よりはるかに効率のよいsiRNAを作製できた（図1）（特許出願番号：特願2003-104940）。
2）新世界ザルによる急性C型肝炎のサロゲートモデルでのsiRNAによる遺伝子治療：
HCVはヒトとチンパンジーにしか感染しないが、GBV-BはHCVに最も近縁なウイルスで遺伝子構造も酷似し、新世界ザル（タマリン/マーモセット）に急性肝炎を惹起する。医薬基盤研究所の明里宏文博士が確立したこの急性C型肝炎のサロゲートサルモデルにおいて、カチオニックべクターを用いたsiRNAの治療実験したところ、図2に示すように5.0 mg/kgのsiRNAで投与10週後でもウイルスの増殖抑制効果を認めた。しかし、コントロールsiRNAにも4週目まで効果があり、その機序としてsiRNA/カチオニックベクターによるインターフェロン反応が関与していることを示した。
図2 マーモセットに、1.3x109GEのGBV-Bの接種後の血清中のGBV-BウイルスRNA量
3) ビタミンEを用いた新規siRNAベクターによる遺伝子治療
我々は最近独自の 新規siRNAベクターの開発し、このベクターを用いたC型肝炎の遺伝子治療の研究は平成20年度の医薬基盤研究所の大型グラント「保健医療分野における基礎研究推進事業」（5年間）に選ばれ、現在研究遂行中である。
(3)ビタミンE単独欠乏性運動失調症の原因遺伝子α-tocopherol transfer protein (αTTP)の発見と発症機序の研究
我々は1987に脂肪吸収不全を伴わない特発性のビタミンE単独欠乏を伴うFriedreich型の脊髄小脳変性症例を発見して、1995年東京大学薬学部新井洋由博士と共同でその原因がαTTP遺伝子の変異であることを明らかにした。
αTTPは肝細胞に発現して、食事から摂取されたキロミクロン中のビタミンE（α-Toc）をVLDLに転送することにより血中のビタミンEレベルを維持しているタンパクである（図上）。さらに2001年に作成したαTTP遺伝子のノックアウトマウスにおいて、αTTPの機能異常によって血中のビタミンEが欠乏して、その結果慢性の酸化ストレスによる進行性運動失調症が発症することを明らかにし、さらにビタミンEを経口投与することにより運動失調が改善することを証明した（下図）。
 αTTPノックアウトマウスでは歩幅が狭く、不規則となり運動失調を発症していることがわかる（A）。ロタロッド運動機能テストでノックアウトマウスは運動機能が障害されるが、ビタミンEの過剰経口投与で回復した（B）、神経病理学的にも脊髄後索の変性が改善した（C）． |
その後、症例を蓄積してこの疾患概念を明らかにして、治療方法を確立した。この1連の臨床的、基礎的研究により、αTTP遺伝子変異による運動失調症はビタミンEの経口投与によって治療が可能であることが明らかとなり、神経変性疾患のなかで数少ない原因治療に成功したと考えている。
(4)免疫性神経疾患における血液脳関門・血液神経関門の破綻メカニズムの解析とその防止を目的とした分子細胞学的研究
多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、CIDPなどをはじめとする免疫性神経疾患の発症は、血液脳関門(BBB)および血液神経関門(BNB)破綻が第一歩となる。当教室では、ウシおよびヒト末梢神経神経内膜微小血管由来内皮細胞の純培養とBNBのin vitroモデルの作成に成功し、現在これらを用いた分子細胞学的研究が進展している。
ウシ末梢神経神経内膜微小血管由来内皮細胞に内皮細胞のマーカーであるAc-LDLをとりこませたもの。この細胞をポリカーボネート膜（孔径0.4mm）上に培養することでBNBのモデルができあがる。
この膜モデルに放射性イヌリンをtracerとして抗 GM1抗体のBNBモデルに対する透過性亢進効果を証明した。
(5)幹細胞を利用した難治性神経疾患に対する再生治療法開発
脳血管疾患、神経変性疾患に対し幹細胞使用した治療法の開発を目指し、以下のような様々な治療戦略の開発を進めている。具体的には、主に疾患モデル動物及び、細胞培養技術を用いて臨床応用へむけた基礎研究を推進している。
- ヒト由来神経幹細胞を使用した脳梗塞の再生治療 (J Neurosci Res. 2004;78:215-23.)
- ヒト由来間葉系幹細胞を使用した脳梗塞及び神経変性疾患の治療 (J Neurosci Res. 2010;88:3598-609.)
- 内在性神経前駆細胞を賦活することによる脳梗塞治療 (PNAS. 2006;103:7112-7., Exp Neurol. 2007;207:302-13.)
- 虚血脳への制御性T細胞誘導による内因性神経前駆細胞の生存賦活 (JCBFM. 2009;29:606-20.)
- ES細胞からプルキンエ細胞を選択的に分化誘導する (J Neurosci Res. 2010;88:234-247)
- ES由来プルキンエ細胞を使用した脊髄小脳変性症モデルマウスの治療法開発
いかにES細胞に全能性があり神経細胞に分化する能力を持つとはいえ、小脳にのみ存在するプルキンエ細胞などを選択的に分化させる技術は殆ど開発されていない。
上図：マウスES 細胞を無血清下で浮遊培養すること（SFEB 法）により神経幹細胞が誘導されるが、この過程で適切な誘導因子を作用させると小脳ニューロン前駆細胞を含む細胞塊が得られる。我々はこれを小脳初代培養系と共培養することによりES 細胞由来のPurkinje 細胞が誘導されることを見出し、これらが形態的、機能的に成熟細胞であることを確認した。 写真：CAG promoter 下にEGFP を発現するES 細胞から誘導された成熟Purkinje 細胞。EGFP とP3 receptor-typeI による免疫二重染色
(6)認知症の病因解明と新たな治療法の開発
現在、日本国内の認知症患者は約160万人といわれている。そして、その約半数がアルツハイマー病であると考えられている。アルツハイマー病は65歳以降にその発症率が急増するため、高齢化社会を迎える我が国においては、効果的な治療法の開発が急務となっている。 アルツハイマー病原因遺伝子の検索により、アルツハイマー病は加齢や遺伝子変異に伴って脳内にアミロイドβ蛋白が蓄積することがきっかけとなり(老人斑の形成：下図)、タウ蛋白のリン酸化を促進(神経原線維変化)し、神経細胞の変性がおこり記憶・思考・計算力・判断力などに障害を来すものと考えられるようになった。
我々はアミロイドβ蛋白産生の重要な役割を果たしているプレセニリンとその関連蛋白に関する研究をトロント大学と共同ですすめている。 2002年にγセクレターゼ複合体の因子候補として新たに報告されたAph-1に関し、我々は他の研究グループに先駆けて、内因性Aph-1が真にγセクレターゼ複合体の因子であることを証明し報告した。そして、Aph-1は複合体の足場的な役割を担っている可能性を示唆するいくつかの重要な所見を報告した(activeなγセクレターゼ複合体の1因子であること、Aph-1の総量がregulationされていること、PSノックアウトによるAph-1の総量への影響がほとんど見られないことなど)。また、同時に報告されたPen-2に関してもその生化学的特性と機能に関し報告した。
アルツハイマー病モデル・マウスの老人斑
プレセニリン複合体構成因子(内因性)Aphー1の細胞内分布
(我々の論文データが抗体メーカーのカタログで使用されたもの)
(7)免疫性神経疾患の新たな治療法の開発
多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症等の自己免疫性神経疾患の治療法については種々の選択肢があるが、その有効性・副作用を考えると必ずしも満足のできるものではない。これらの疾患動物モデルとして実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）・実験的アレルギー性神経炎（EAN）等を用いて、サイトカイン・ケモカイン・神経接着因子・転写因子等をターゲットとした新たな治療法の開発を試みている。
(8)脳・神経生理機能の解析による神経疾患の病態生理解明および新しい診断法の開発
経頭蓋磁気刺激、誘発脳波などの電気生理学的手法およびPETなどの機能画像を駆使して中枢神経系の伝導、興奮・抑制機構、運動感覚連関などを解析し、様々な中枢神経疾患や疾患に伴う不随意運動などの症状の病態生理解明を進めている。磁気刺激を用いた皮質延髄路の機能評価や末梢神経近位部の伝導障害の評価など新しい診断法の開発にも取り組んでいる。
(9)神経・筋疾患の病理学的研究
病理部門では大きく2つの役割を担っています。1つは臨床診断で、当研究室では大学病院をはじめ、関連施設から年間100～150例の末梢神経・筋生検組織が届けられ、標本作製から診断までという大変重要な部分を行っています。また診断には分子生物学的手法を用いることもあります。 もう1つは臨床研究です。遠位型ミオパチーの1型であるDMRVの原因遺伝子の同定し、現在は後発症機序の解明に努めています。その他、各種筋ジストロフィーや筋炎、末梢神経炎の病態解明を目指し、研究を進めています。
DMRV筋の抗GNE抗体を用いた免疫組織染色化学(上図の説明)
縁取り空胞（矢印）だけでなく核（矢頭）にも 原因タンパクであるGNEが存在していることが分かる（矢印）。
