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実験プロトコル

酵母ツーハイブリッド法

A. Small scale (Back Check)

Back Check
まず、作製したbait DNAがbait自体でβ-Gal活性を誘導しないことを確認する。ここでβ-Gal活性が誘導されるようであれば、そのbait DNAを用いることは出来ない。
 
Small scale
Large scale後にbait DNAとprey DNAでretransformationを行うことでβ-Gal活性が誘導されるかを確認する。ここでβ-Gal活性が誘導されれば、そのpreyクローンをシーケンスにかける。

事前準備:-UTL plate, -UT plate, YPA(D), TE, 100mM Lithium Acetate/0.5% TE, 100mM LiAc - 40% PEG/1x TE, DMSO

すべて無菌操作

前日 A.M.

  1. 50ml culture bottleにYPAD【10ml】を入れる→1bottleで20サンプル分
    (コンタミ確認用にYPADのみのbottleも用意する)
  2. Yeast株【L-40】 plateからYeastを竹串で削ってinoculateする
  3. 30℃のincubatorにいれて150rpm O/N

当日 A.M.

準備:-UT plate,-UTL plate:常温下へだしておく。

  1. 前日のL-40(in culture bottle)にYPAD【30ml】を加える
  2. 30℃のincubatorにいれて150rpm 3 ̄6hours

当日 P.M.

準備:Salmon sperm DNA(carrier DNA):80℃で5〜10min熱処理

Water bath:42℃に設定する
Block incubator:30℃に設定する
DNA tube:エッペンチューブ×sample数×2(−UT用,−UTL用)
bait vector:ex.BTM116 KM S-SCAM 2 621
prey vector:ex.pVP Syntaxine
→Back checkではbait自体がβ-gal活性を誘導するかの確認なので、preyは相互作用しないものを用いる

  1. L-40(in culture bottle)を50ml corning tubeに移す
  2. 遠心2,500rpm 5min RT
  3. Supをdecantで捨てpelletをTE【40ml】で洗いこむ
    →Culture bottleが複数本ある場合はTE【20ml】×2回で洗い、一本にまとめる
  4. 遠心2,500rpm 5min RT
  5. Supをdecantで捨てpelletを100mM Lithium Acetate/0.5% TE【L-40 bottle数×2ml】で10回以上ピペッティングしてresusupendする
  6. 1〜5の間に各DNA tubeに
    -UT用:bait vector【2 ̄3μl】+ Salmon sperm DNA【10μl】
    -UTL用:bait vector【2 ̄3μl】+ prey vector【3μl】+ Salmon sperm DNA【10μl】を入れておく
  7. 6のtubeに5のYeast液【100μl】を加える
  8. 100mM LiAc - 40% PEG/1x TE【700μl】を加えて、よく混和する
  9. 30℃のincubatorにいれて30min
  10. DMSO【88μl】加えて、よく混和する
  11. 42℃のWater bathに6 ̄7minつけてheat shock
  12. 遠心9,000pm 1min
  13. Supをdecantで捨て、TE【1ml】を加えて、よく混和する
  14. 遠心9,000rpm 1min
  15. Supをdecantで捨て、残ったSupでpelletをresusupend
  16. 全量【100μl】を-UT plate,-UTL plate上に広げる
  17. 30℃のincubatorに入れて3days


-UTL plateはβ-gal assayへ
-UT plateはbaitのLarge scaleのscreeningに使用する

B. β- galactosidase assay

Back Check
青色が呈されれば、そのbait DNAを用いることは出来ない。
Small scale
青色が呈されれば、preyクローンをシーケンスにかける。

準備:Z buffer、X-gal(60mg/ml)、液体窒素、色素、フィルターペーパー、Milliporeフィルター、15cm dish、50cc Corning tube、ピンセット×2

手袋着用

  1. フィルターペーパーを15cm dishの蓋に入るように切っていれる
  2. Z buffer【5ml/dish】とX-gal【50μl/dish】を50cc Corning tubeに入れてよく混和し、フィルターペーパー全体にかける
  3. 浅い発泡スチロールの蓋の中にアルミを敷いて、液体窒素をいれる
  4. Milliporeフィルターを-UTL plateに被せて、Yeastコロニーのレプリカを取る
    →Milliporeフィルターは直接手で触らずにピンセットを使って持ち、レプリカを取るときは両端をピンセットで持って中央から被せていく(空気が入らないよう注意)
  5. 上下が分かるように色素で印をつける
    →1枚目なら上に1点・下に2点、2枚目なら上に2点・下に3点
  6. Milliporeフィルターをはがし、Yeast接触面を上にして液体窒素に30sec浸す
  7. Milliporeフィルターを取り出し、Yeast接触面を上にしてX-galをふくませたフィルターペーパー上に乗せる
  8. 30℃のincubatorで30min
  9. 紙の上において乾燥させ陽性(青色)か陰性(不染)か判定する

判定

 

Back check

×

○→Large scaleへ

Small scale

○→シーケンスへ

×

 

C. Large scale

事前準備:-THULL plate,-UTL plate, -UT plate ,-UT液体培地
TE, 100mM Lithium Acetate/0.5% TE, 100mM LiAc-40% PEG/1xTE, DMSO
Yeast culture用500mlボトル+Yeast用遠心チューブをautoclaveしておく

常に無菌操作

2日前 A.M.

  1. Yeast培養用チューブに‐UT【2ml】[Asp(5ml/l), Thr(2.5ml/l), autoclaved 20% glucose(100ml/l)入り]をいれる
  2. 使用するYeastを‐UT plate上のコロニーからinoculateする
  3. 30℃のincubatorにいれて150rpm O/N

1日前 A.M.

準備:YPA/YPAD(培養用2ℓ+洗浄用1ℓ)の作製, 空2ℓフラスコ
→上記はすべてオートクレーブしておく

  1. autoclaved 500mlボトルに-UT【100ml】[Asp(5ml/l), Thr(2.5ml/l), autoclaved 20% glucose(100ml/l)入り]をいれる
  2. 前日からincubateしているYeast(in -UT【2ml】)を底の塊を軽く崩してから、ブルーチップを用いて1の 500ml ボトルに移す
  3. 30℃のincubatorにいれて150rpm O/N

YPA/YPAD(培養用2+洗浄用1ℓ)の作製

  1. 攪拌容器にスターリングバーをいれる
  2. MilliQ【900ml/ℓ】, Yeast extract【10g/ℓ】, Peptone【20g/ℓ】, adenin【0.1g/ℓ】を入れて溶解するまで十分攪拌する
  3. 2ℓフラスコに900ml×2, YPA用のボトルに450ml×2いれる
  4. 空の2ℓフラスコと共にautoclave 121℃, 20min.
    →D(glucose)は使うときに追加

当日 A.M.

準備:遠心機にローターNo.29をセットし20℃にしておく

  1. autoclaved YPA の内、1本(in 2ℓフラスコ)に20% glucose【100ml】を加えてYPADにする
  2. YPADに前日のYeast(in 500mlボトル)をdecantで加える
    →最後に空きボトルの匂いをかいでコンタミしていないかチェック
    →使用する検体が複数あってもこの段階で一緒にする…3〜4検体までは1つで可能
  3. 30℃のincubatorにいれて150rpm, 3hours.

当日 P.M.

準備:Water bath:42℃に設定する

Salmon sperm DNA(carrier DNA):80℃で5〜10min熱処理
-UTL plate, -THULL plateを常温下へだす

  1. YPAD+Yeast(in 2ℓフラスコ)をautoclaved遠心チューブ4本にフラスコからdecantで6 ̄7分目まで注ぎ込む
  2. 遠心5,000rpm 8min 20℃
  3. Supはdecantでビーカーに捨てる
    →酵母のpelletは柔らかいので遠心終了後すぐに行う・・・以下の遠心も同じ
  4. 残りのYPAD+Yeast(in 2ℓフラスコ)を上記3の遠心チューブに注ぎ込む
  5. 遠心5,000rpm 8min 20℃
  6. Supを捨て、TE【30ml】で2本の遠心チューブのpelletを1本にまとめ、さらにTE【30ml】で洗いこむ(Total 60ml×2本)
  7. 遠心 5,000rpm 8min 20℃
    →5 ̄7の間に50ml Corning tubeにSalmon sperm DNA【1ml】とlibrary DNA【100μl】をいれておく
  8. Supを捨て、100mM Lithium Acetate/0.5% TE【10ml】で2本の遠心チューブのpelletを1本にまとめ、DNA入り50ml Corning tubeにいれ、さらに100mM Lithium Acetate/0.5% TE【10ml】で洗いこむ (total 20ml)
  9. autoclaved空き2ℓフラスコに移し、50ml tubeを100mM LiAc-40% PEG/1xTE【140ml】で洗いこむ
    →decantでビンからチューブにいれてチューブからフラスコでよい
  10. 30℃のincubatorにいれて75rpm 30min
  11. DMSO【17.6ml】を加えて攪拌する
    →DMSOは引火性なのでバーナーはここだけ消す
  12. フラスコを6 ̄7min.42℃のWater bathにつけて時々フラスコを揺らしながらheat shock
  13. autoclaved YPA【100ml】(in 500mlボトル)をフラスコに加えてよく混ぜ、2本の遠心チューブにいれる
  14. 遠心5,000rpm 8min 20℃
  15. Supを捨て、pelletをYPA【30ml】でresuspendする
    →まだまとめない
  16. 遠心5,000rpm 8min 20℃
    →autoclaved YPA (in 2ℓフラスコ)に20% glucose【100ml】を加えてYPADにする
  17. Supを捨て、YPA【10ml】で2本の遠心チューブのpelletをまとめて、さらにYPA【10ml】で洗いこむ (Total 20ml×1本)
  18. YPAD(in 2ℓフラスコ)に移す
  19. 30℃のincubatorに入れる130rpm,60min. →Recovery phase
  20. 1mlを-UTL用エッペンチューブに取り分けてから、autoclaved遠心チューブ4本にフラスコからdecantで6 ̄7分目まで注ぎ込む

<-THULL>

<-UTL>

21. 遠心5,000rpm 8min 20℃
22. Supはdecantでビーカーに捨て、残りのYPAD+Yeast(in 2?フラスコ)を遠心チューブに注ぎ込む
23. 遠心5,000rpm 8min 20℃
24. Supを捨て、TE【30ml】で2本の遠心チューブのpelletを1本にまとめ、さらにTE【30ml】で洗いこむ(Total 60ml×2本)
25. 遠心 5,000rpm 8min 20℃
26. Supを捨て、TE【30ml】で2本の遠心チューブのpelletを1本にまとめ、さらにTE【30ml】で洗いこむ(Total 60ml×1本)
27. 遠心 5,000rpm 8min 20℃
28. Supを捨て、TE【12.5ml】でpelletをresusupend
29. 50ml Corning tubeへ移す
30. −THULL plateに300 ̄400μl/plateまく

31. 30℃のincubatorにいれ、5 ̄7days

□ 青色のコロニーを数え、DNA回収へ

21.エッペンチューブを遠心10,000rpm 1min RT
22.Supを捨て、TE【1ml】でpelletを洗う
23.遠心10,000rpm 1min RT
24. Supを捨て、TE【1ml】でpelletをresuspend
25. −UTL plateを2分し、上記24を10ul・100μl落とし、10μl側から広げる
26. 30℃のincubatorにいれ、3days.
→preyが入っていれば生える

□ 白色のコロニーを数える

10μlにa個=a×105

100μlにb個=b×104

a×105 ̄b×104のtransformation efficiency

DNA libraryが入った数

 

D. DNA回収

Large scaleで青色を呈したコロニーはbaitとpreyが相互作用したものと考えられるため、このコロニーDNAを回収する。

常に無菌操作

2日前 A.M.

準備:スクリーニングしてとれたblue colonyにnumberをつける
master plate(-THULL plate)を常温下にだして区切り線を引いておく
Yeast培養用チューブにnumberをかいておく

  1. -UTL【3ml】(Asp(5ml/l), Thr(2.5ml/l), autoclaved glucose(100ml/l)入り)をYeast培養用チューブに加える
  2. blue colonyを-UTLにinoculateし、master plateにもinoculateする
  3. -UTL:30℃のincubatorにいれて150rpm 2days.
    master plate:30℃のincubatorにいれて2 ̄3days →Yeastが生えたら4℃保管

当日

フェノール抽出・エタノール沈殿

準備:autoclavedエッペンチューブ×sample数

non-autoclavedエッペンチューブ×sample数

Yeast lysis buffer(2.5M LiCl, 50mM Tris/HCl, pH8.0, 0.4%TritonX-100, 62.5mM EDTA)

フェノール/クロロホルム

ガラスビーズ(乾熱滅菌済み)

70%エタノール、TE、 3M NaOAc、 cold 100%エタノール

  1. non-autoclaved-エッペンチューブにガラスビーズ【約150μl】を入れる
  2. Yeast培養用チューブの蓋をとり、遠心2,500rpm 5min RT
  3. Supを捨て、Yeast lysis buffer【300μl】を加えvortexしてガラスビーズ入りエッペンチューブに移す
  4. フェノール/クロロホルム【300μl】を加える
  5. Vortex on Micro tube mixture 5min
  6. 遠心 15,000rpm 5min. RT
  7. 上層の白濁したSupを回収してautoclavedエッペンチューブに移す
  8. cold 100%エタノール【1ml】を加え、転倒混和
  9. 遠心15,000rpm 15min 4℃
  10. Supを捨て、70%エタノール【1ml】を加える
  11. 遠心15,000rpm 3min RT
  12. Supを捨て、TE【100μl】(2回目50μl)を加える
  13. Vortex on Mirtotube mixture 2min
  14. 3M NaOAc【10μl】(2回目5μl)とcoldエタノール【250μl】(2回目150μl)を加え、転倒混和
  15. 遠心15,000rpm 15min 4℃
  16. Supを捨て、70%エタノール【1ml】を加える
  17. 遠心15,000rpm 3min RT
  18. 12 ̄17を2回繰り返して、最後はspeedvacで2 ̄3min乾燥
  19. 1/2 TE【25μl】にresuspendし、vortex on Microtube mixture 3min

E. Electroporation・miniprep

E.coli(XL-1 blue electrocompetent cell)へのElectoroporation

準備:

  • キュベット×sample数+α →on iceで冷やしておく
  • autoclavedエッペンチューブ×sample数+α×2 →on iceで冷やしておく
  • 1ml LB(Ampなし)入りautoclavedエッペンチューブ×sample数+α

パスツールピペット(乾熱滅菌済み)

LB-Amp plate

  1. Electroporation machineのセッティング
    SET VOLT→1.8kVにセット
    Capacitance→25μFにセット
    Resistance→200ohmsにセット
    Time const→0にセット
  2. 1/2 TEに溶かしたsample DNAを遠心9,000rpm 2min RT
  3. E.coli(XL-1 blue electrocompetent cell)をon iceで溶かす
    →sample数分まとめて持ってくるのではなく、ストックを一本一本もってくる
  4. autoclavedエッペンチューブにelectrocompetent cell【20μl】を加える
  5. sampleのDNAを【1μl】加え、全量をキュベットへ入れる
  6. キュベットの底を叩き、周りについている水をふき取りElectroporation machineへセットし、switch on(音がしたらすぐにswith off → 4.5以上ならOK)
  7. 1ml LB(Ampなし)入りautoclavedエッペンチューブのLBをパスツールピペットで一部とって、キュベットに加えてよく洗いこみ、元のtube内へ戻す
  8. 37℃のincubatorで1hour(サンプル数が多いときは気相でよい)
  9. 遠心9,000rpm 1min RT
  10. Supを捨て、残ったSupでresuspend
  11. LB-Amp plateにまく
  12. 37℃のincubatorでO/N

LB-Amp plateへのinoculate

準備:

  • LB-Amp in two position tube
  • LB-Amp plate
  1. two position tubeにLB-amp【2ml】を加える
  2. Electoroporationして生えたコロニーを1 or 2(2以上コロニーが出ても2コロニーでよい)をLB-amp【2ml】in two position tubeにinoculateし、master plat(LB-Amp plate)にもinoculate
  3. 3. two position tubeは37℃のincubatorで6.5 ̄O/N

master plateは37℃のincubatorにいれ菌が生えたら、4℃保管

miniprep (express mini)

準備:

  • autoclavedエッペンチューブ(×sample×2)
  • non-autoclavedエッペンチューブ(×sample)
  • TEG[Tris-EDTA-glucose]
  • 2% SDS-0.2N NaOH
  • TE/RNase[TE+ 10mg/ml RNase]
  1. 15ml two position tubeの蓋をすべて取り、遠心3,300rpm 5min RT
  2. 発泡スチロールのチューブ立てにtubeを立て、Supをまとめて捨て、キムタオルの上で逆さにして水切りする
  3. TEG【100μl】入れる
  4. まとめてVortex →上から見てresuspendの確認をする
  5. 2% SDS-0.2N NaOH【200μl】加え、5min置いてアルカリ化
    →Vortex禁止(chromosomal DNAが出てきてしまうから)
  6. 5M KoAc【150μl】加え、まとめてVortex → ゲノムDNAが出てきて沈殿する
  7. フェノール/クロロホルム【100μl】加え、まとめてVortex
  8. decantでnon-autoclavedエッペンへ移す
  9. 遠心15,000rpm 3min RT
  10. 透明なSup【500μl】をautoclavedエッペンへ移す
  11. cold 100% エタノール【1ml】をガラスピペットで加えて、転倒混和
    →エタノール濃度が66.6%以上になればよいのでエッペンの縁少し下までいれればよい
  12. 遠心15,000rpm 15min 4℃
  13. Supを捨てて100% EtOH【200-300μl】をガラスピペットで加える →混和はしない
  14. Supを捨てて、チューブを立てかけて軽く乾燥させ、speedvac 2minで乾燥させる
  15. TE/RNase【25-40μl】を加えてRNAを失活させる
  16. 溶けるまでVortex 3min RT

制限酵素消化

準備:

  • ECoRI(GAATTCを切断)
  • XhoI(CTCGAGを切断)
  • autoclavedエッペンチューブ(×sample+1)
  • 10x buffer(3), TE
  • loading buffer →エッペンに取り分けておく

Agarose gel

  1. 10x buffer【2μl】+ Enz【各0.2μl】+ TE【13μl】をsample本数分まとめて作る
  2. エッペンへ上記【15μl】+ DNA【5μl】加える
  3. →DNAの残りはキャップに正確な名前を書いて保存する。
  4. Water bath 37℃ 2hours →この間にAgarose gelの作製
  5. loading buffer【5μl】加える
  6. 全量をchargeする。
  7. 電気泳動 Constant Cultent 200mA 200V 30 ̄50min
  8. UVイルミネーターで印刷

判定

  • vectorの有無とfragmentの有無を確認
  • 例. 00a,01a,01bがあったとして
  • すべてDNA回収がうまくいっていれば
  • 00a, 01a = 01bなので01a or 01bのどちらかをsmall scaleでYeastにリトランスフォームしてβ-gal assayする

Agarose gelの作製

  1. 300ml三角フラスコにスターリングバー+DW【200ml】+50x TAE【3ml】+Agarose【2ml】
  2. 電子レンジ強3 ̄4minして冷めるまで攪拌し(約20min)
  3. ゲル版を組み立て、32レーン×2のコームを準備する
  4. EtBr【10μl】加える
  5. アガロースゲルを流しいれ、コームを入れる(約20minで固まる) →泡は火であぶる
  6. 泳動槽内は水【2l】+ 50xTAE【30ml】+EtBr【100μl】として、ゲル版を入れる。

F. 試薬・selection plate/mediumの作製

試薬

・TE【500ml】 autoclave
5.0ml 1M Tris-HCl, pH8.0
1.0ml 0.5M EDTA, pH8.0
- milliQ

・100mM Lithium Acetate/0.5% TE【500ml】 autoclave

3.3g

Lithium Acetate(MW 65.99)
2.5ml 1M Tris-HCl, pH8.0
0.5ml 0.5M EDTA, pH8.0
- milliQ

・100mM Lithium Acetate/40% PEG/1x TE【500ml】 autoclave
3.3g Lithium Acetate(MW 65.99)
200g Polyethylenglycol(wt.3,350)
5.0ml 1M Tris-HCl, pH8.0
1.0ml 0.5M EDTA, pH8.0
- milliQ

 

Selection plate/mediumの作製

準備:

  • autoclaved 20% glucose
  • 1g/ 100ml filtrated Asp(L-asparatic acids)
  • 4g/100ml fltrated Thr(L(-)threonine)
  • 1M 3AT(3amino triazol)
  • 1M X-gal(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside)

THULL plate作製 50枚(1L= 20枚なので3L分作る)

  1. 攪拌容器を洗い、スターリングバーをいれる
  2. 溶液を作る
    DW 【0.9ml/l】
    Yeast nitrogen without amino acids 【1.2g/l】
    Ammonium sulfate 【5g/l】
    Succinic acids 【10g/l】
    NaOH 【6g/l】
  3. amino acidsを加える
    【0.1g/l】:Ade(Adenin), Arg(L(+)Arginine, Cys(L(-)Cysteine)
    【0.05g/l】:Ile(L(+)Isoleucine), Met(L-Metionine, Phe(L(-)Phenylalanine)
    Pro(L(-)Proline), Ser(L-serine), Tyr(L-Tyrosine), Val(L-Valine)
  4. 【1350ml】をスターリングバー入り2lフラスコへ入れる
  5. Bacto agar【20g/l】を入れ、D(‐), Asp(-), Thr(-)と記載する
  6. 121℃ 15min autoclave
  7. 冷めてきたことを確認し、以下を加える
    autoclaved 20% glucose【100ml/l】
    1g/ 100ml filtrated Asp 【5ml/l】
    4g/100ml fltrated Thr 【2.5ml/l】
    1M 3AT【8ml/l】
    1M X-gal【2ml/l】
  8. 混ぜた後、plateにまく

UTL, UT mediumplateの作製 (plateは10枚あれば十分である)

  1. ‐THULL作製の3までは同じ
  2. medium:【450ml】を500ml bottleへいれる
    plate:【450ml〜1350ml】をスターリングバー入りフラスコへ入れる
  3. medium:蓋にD(‐), Asp(-), Thr(-)と記載する
    plate:Bacto agar【20g/l】を入れ、D(‐), Asp(-), Thr(-)と記載する
  4. 121℃ 15min autoclave
  5. medium:使用時に20% glucose【50ml】, Asp 【2.5ml】, Thr 【1.25ml】を入れる
    plate:冷めてきたことを確認し、以下を加える
    autoclaved 20% glucose【100ml/l】
    1g/ 100ml filtrated Asp 【5ml/l】
    4g/100ml fltrated Thr 【2.5ml/l】
  6. 混ぜた後、plateにまく

G. Electrocompetent cellの作製

回収作業中も常にon iceにして、温度を上げないことがよい細胞をえるコツである。

前日準備

  1. ドライアイスの確認をし、LB 1ℓ in 2ℓフラスコ、MilliQ 1.5ℓ in 2ℓフラスコ、E.coli用遠心チューブ×6、10% GlycerolをautoclaveしMilliQとGlycerolは低温室で保存
  2. XL-1をLB medium【10ml】にinoculateして37℃でo/n

当日

準備:エッペンチューブ×5 ̄10、50ccコーニングチューブ×1

MilliQ、Glycerol、E.coli用遠心チューブ×12はon iceにしておく

遠心ローターNo25,30を4℃にしておく

  1. 2ℓフラスコ内のLB mediumを【1ml】エッペンにとりわけて、前日から培養しているXL-1をLB1ℓに移して37℃でincubate
  2. 30min毎に1ml程度をサンプルとしてとりOD600を測定する
  3. OD600が0.4 ̄0.5になったら(2〜3hr程度)、大腸菌用遠心チューブで遠心5,000rpm 10min 4℃
  4. Supを捨て、on iceのMilliQ【50 ̄100ml】を加え、ガラスピペットでresuspend
  5. 遠心5,000rpm 10min 4℃
  6. Supを捨て、MilliQ【50 ̄100ml】で洗いこみ、遠心チューブ4本→2本(100 ̄200ml×2)にする
  7. 遠心5,000rpm 10min 4℃
  8. Supを捨ててpelletをMilliQ【25ml】で洗いこみ、50ccコーニングチューブ(50ml×1)に移し、遠心6,000rpm 10min 4℃
  9. Supを捨て、冷やした10% Glycerol【20ml】でresuspendし、
    遠心6,000rpm 10min 4℃
  10. Supを捨て、10% Glycerol【2ml】でresuspendし、チューブに200μlづつ分注しethanol/dry iceに30sec以上つけて急速に冷やす。
  11. -80℃で保管
    →その日に使う場合でも一度凍らせること