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東京医科歯科大学　難治疾患研究所　ゲノム解析室　

M&Dタワー２２F　南西角
内線（4960）
kaisekisitsu.nri@mri.tmd.ac.jp

DNAシークエンスサービス内容


泳動のみのサンプルについて

1.サンプルの状態

精製後、ドライアップした状態で提出してください。
精製方法等は、以下の４を参考にしてください。

２.蛍光試薬について

以下に示すApplied Biosystems社のいずれかのKitを使用してください。
・BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit,
・BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
・dGTP BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction　Kit


３.tube等

メーカーは問いませんが、できれば1.5ml　tubeを使用してください。
plateで提出する場合には、ご相談ください。
サンプルを持参できる時間がわかりましたら、予めメールにて、持参する時間、本数、sample name等をご連絡下さい。


４.シークエンスサンプルの調整方法

（１）反応液調整

 BigDye Terminator 　※１  8μL
 5X Sequencing Buffer  ※2
 Primer  3.2 pmol
 Deionized Water  up to 20μL
 Total Volume 　  　20μL

※１購入したBigDye Terminatorを右図の割合で希釈する。
適量ずつ分注し、すぐに使用しないものは-20℃保存。一度解凍したものは冷蔵保存。　
BigDye Terminator   100μL
 5X Sequencing Buffer  350μL
 Deionized Water  350μL
 Total Volume 　  800μL
 

※２Template使用量は、以下を参考に加えてください。

Single-stranded DNA  25-50 ng 
 Double-stranded DNA  150-300 ng
 PCR Products(100-200 bp)  1-3 ng
 ( 200-500 bp)  3-10 ng
 ( 200-500 bp)  5-20 ng
 (1000-2000 bp)  10-40 ng
 ( 　>2000　bp)  20-50 ng




(2)Thermal cycling

Hold  96℃　１min   
 Cycle  96℃　１０sec  25cycles 
 50℃　5sec
 60℃　4min
 Hold  ４℃　store  



(3)エタノール沈殿による精製(マイクロチューブの場合）