東京医科歯科大学　難治疾患研究所　ゲノム解析室　

シークエンス反応からのサンプルについて

1.サンプル調整

　^{＋　　＋　　＝}
　となるように、PCR用0.2ml tube（8連、12連tube不可）または96穴プレートに分注してください。サンプル数が概ね32を超える場合には、出来るだけプレートも用いて下さい。96穴プレートには、サンプルを縦に8サンプルずつ、間を空けないで入れてください。　　　
　　　　　　


＊ゲノム解析室で、これらにBigDye Terminator Reaction Kitを 5×Sequencing Bufferで1/8に希釈したものを8.0μl加え、final volume 20μlとして、シークエンス反応を行います。　

2.Template量およびPrimer量の目安

Template	Quantity
PCR product
100-200bp	1-3ng
200-500bp	3-10ng
500-1000bp	5-20ng
1000-2000bp	10-40ng
＞　2000bp	20-50ng
Single-stranded	25-50ng
Double-stranded Plasmid	150-300ng
Cosmid, BAC	0.5-1.0μg
Bacterial genomic DNA	2-3μg
Primer	3.2 pmol

３.蛍光試薬

反応には、Applied BiosystemsのBigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit, BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitまたは dGTP BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction　Kitを1/8に希釈して用います。
※Large DNA(Cosmid,BAC等）の場合には、BigDye V3.1を希釈しないで用い、PCRを60cycles行います。

それぞれの試薬の特徴は以下の通りですが、原則として初めてシークエンスを行う場合には、BigDye v3.1の使用をお勧めします。
・BigDye v1.1
未反応のdyeの信号により、40bp付近が前後10bp位読めないことがあります。Top heavy(始めは信号が強いが、だんだん弱くなる)になり易い。
・BigDye v3.1
未反応のdyeの信号により、80bp付近が前後10bp位読めないことがあります。GC-, C-rich Templateでもv1.1に比べ読みやすい。
・dGTP BigDye
GT-、G-richおよび2次構造をとる Template用　
※一部読みにくくなる箇所がありますが、v1.1やv3.1で読めない配列が読めることがあります。