1.        細胞周期制御に関わる研究

分子細胞遺伝　

小谷秀示

細胞はいかにして増殖、分化するのか？この問題は 100年以上にもわたって生物学者を魅了し続けてきたテーマである。私が、この研究に従事し始めた大学院生の頃は、細胞周期を制御するとされていたキナーゼは Cdc2で、制御因子としての Cyclin A、Bがあるだけだった。しかし、今日、この研究分野は飛躍的に解明が進み、莫大な数の因子が一つの細胞を二つに分裂させるのに関わっていることが解ってきた。現在、細胞分裂期を制御に関して、ユビキチン化や染色体分配などを取り上げ、総括的なシステムバイオロジーの研究や siRNAに関する研究も行っている。今回は、大学院生の研究も含めて、研究の進捗状況に関してご報告したいと思う。

 

2.        MEKK2活性制御機構の解明

西頭　英起
 Mitogen-activated protein kinase(MAPK) シグナル伝達経路は、細胞内シグナル伝達経路の一つであり、増殖、分化、アポトーシスなどの細胞応答を誘導することにより、生体内の多くの局面において重要な役割を果たしている。様々な刺激や受容体からのシグナルは、MAPK kinase kinase(MAPKKK)、MAPK kinase(MAPKK)、MAPKを逐次リン酸化することにより活性化し、最終的に活性化されたMAPKは、転写因子などのタンパク質をリン酸化することによって核内や細胞内オルガネラへとシグナルを伝達する。特にMAPKKKは、このシグナル伝達経路の最上流に位置し、多様な細胞外からの刺激を認識し下流へとシグナルを伝達する、いわばストレスセンサーとしての役割を担うものと考えられている。従って、MAPKKK活性制御機構の解明は、細胞の刺激に対する多様な反応性の解明につながると考えられ、極めて重要である。
　哺乳類において少なくとも15種類以上報告されているMAPKKKの一つであるMAPK/extracellular regulated kinase（ERK）kinase 2（MEKK2）は、619アミノ酸からなる約80kDaのセリン・スレオニンキナーゼである。活性化されたMEKK2は、最終的にERK経路、c-Jun NH2-terminal kinase（JNK）経路ならびにp38経路を活性化することが知られている。また、MEKK2は硬組織を含む組織全般に発現しているが、中でも脾臓や白血球などに多く発現しており、生化学的な解析およびMEKK2ノックアウトマウスの解析から、免疫系のシグナル伝達に関与することが報告されている。しかしながら、その活性制御機構や、免疫系以外の細胞におけるMEKK2の役割については不明な点が多い。そこで本研究は、MEKK2活性制御機構の解明を目的として新たな結合分子の同定を試み、さらにその生理的役割について検討を行った。

 

3.        ＮFATc1による破骨細胞分化制御機構の解明

東京医科歯科大学大学院分子細胞機能学　高柳　広

骨破壊を制御するための分子標的を同定するため、破骨細胞の分化を制御するサイトカインRANKL (receptor activator of NF-kB ligand)の細胞内シグナル伝達機構とその制御メカニズムの研究を行ってきた。これまでの研究により、nuclear factor of activated T cells c1 (NFATc1)が RANKLシグナルを統合するマスター転写因子であること、関節リウマチの有望な治療標的であることを明らかにした。そして、NFAT活性化に関与するカルシウムシグナルの起源を探索し、免疫グロブリン様受容体の意義の解析を続けている。さらに、現在、NFATc1の誘導機構におけるNF-kBの意義、NFATc1転写複合体におけるPU.1, MITFの関与などが明らかになってきた。現在進行中のプロジェクトを挙げる。

l         NFATc1結合タンパクの解析

l         NFATc1のin vivoでの必須性の証明                                      

l         FK506投与の生体レベルでの意義

l         NFATc1遺伝子の骨芽細胞における意義の解析

l         ＦcR/DAP12二重欠損マウスにおける骨芽細胞の解析

l         免疫受容体のリガンド/発現細胞

l         NFATc1プロモーターの解析

l         NFATc1の自己増幅を制御するメカニズムの同定

 

4.        軟骨分化におけるRunxファミリーの役割（仮）

竹田　秀

関節軟膏の分化調節機構は不明な点が多い。加えて、変形性関節症をはじめとした軟骨変性疾患に対する特異的な治療法の確立も望まれている。我々は軟骨特異的にRunx2を発現するトランスジェニックマウスを作成しRunxが軟骨細胞肥大化に重要であることを報告した。さらに、我々は軟骨特異的にそれぞれRunx1,3を発現する遺伝子改変マウスも作成した。Preliminaryな検討ではこれらのマウスは変形性関節症様の表現形を呈することを観察している。そこで関節軟骨分化および軟骨変性疾患におけるRunxファミリーの役割について、これらのマウス及びRunx2ヘテロマウスを用いて現在検討を進めている。

 

 

5.        Transgenic Mice Expressing a Inducible Cre Recombinase in Osteoblasts and Odontoblasts : A New Tool to Examine Postnatal Bone and Tooth Physiology

中島　和久

Purpose

Homologous recombination in ES cells to manipulate genes of interest enhances our knowledge in genetic pathways controlling embryonic skeletogenesis. However, embryonic and postnatal lethality of mutant mice prevented further studies on the role of these genes in postnatal development and bone related diseases. Regulated somatic mutagenesis during skeletogenesis is a requisite to overcome these difficulties. We generated transgenic mice lines expressing a bacteriophage P1 Cre recombinase fused to a mutated ligand-binding domain of the human estrogen receptor under the control of the mouse pro(I) collagen (Col1a1) gene proximal promoter, which is active in osteoblasts throughout their differentiation.

Results and Discussion

We have used a 2.3 kb promoter fragment of the mouse Col1a1 gene to target expression of Cre recombinase to osteoblasts and odontoblasts. In addition, this Cre recombinase, which is a fusion polypeptide with a mutant ligand binding domain of the estrogen receptor, becoming active only after administration of 4-hydroxytamoxifen (4-OHT). Our results show that the Cre-ERT2 gene is expressed specifically in osteoblasts and odontoblasts and that the Cre recombinase is only active after systemic administration of 4-OHT. We estimate that Cre-ERT2 is expressed in a large majority of osteoblasts at 18.5 dpc. This appears also to be the case 3 weeks after birth although the penetration of X-gal at that time may be more difficult. These results suggested we could easily control the time to activate Cre recombinase in osteoblasts by regulating the time for administration of 4-OHT. To allow temporally controlled recombination by administration of 4-OHT is very important to study for postnatal bone formation. Thus, the advantage of the mouse strain that we have generated is that it well allows examination of the consequence of the abletion of a number of specific genes after birth. Thus we believe that the Col1a1-CreERT2 transgenic mice we have generated will be an important tool to study bone physiology.

 

6.        歯髄細胞の象牙芽細胞への分化におけるFGF18の関与

歯髄生物　川島伸之

歯を口腔内に長期にわたり保存していく上で、歯髄の存在は重要な要素のひとつである。臨床上、う蝕、破折等の理由により、抜髄が余儀なくされるのは、炎症をコントロールすることができないためであると同時に、再び象牙質を誘導することが難しいことに起因する。しかし、歯髄における硬組織形成を担う象牙芽細胞の分化メカニズムについてはまだほとんどわかっていない。ところで、歯の形態形成においては、さまざまな因子が関与している。すなわち、BMP、FGFをはじめとする増殖因子や、Msxをはじめとする転写調節因子、その他Shh、Wntなどの関与が重要であると考えられている。しかし、象牙芽細胞の分化に関与する遺伝子については、どの因子が重要であるのかいまだ不明である。象牙芽細胞の分化は、発生過程においては、上皮間葉相互作用が重要な働きを担っているが、歯髄細胞単独であっても象牙芽細胞に分化する能力を有している。したがって、歯髄細胞のプロパティを解明することは、象牙芽細胞への分化メカニズムの解明に寄与できるものと期待される。

FGF18は、脊椎動物の骨格形成に重要であると報告されている成長因子であるが、申請者らはFGF18が歯髄組織においても強く発現していることを認めた。FGF18が、硬組織形成に関与することから、歯髄においても象牙芽細胞への分化、あるいは硬組織形成に関与している可能性が高いと思われる。今回、FGF18の歯髄細胞における機能を調べるとともに、FGF18により歯髄細胞が象牙芽細胞へ分化誘導される可能性について検討する。

 

 

7.        Consortium biofilms formation in a human oral microcosm

Cariology and Operative Dentistry         hairul Matin

Abstract

In recent years biofilms have been intensively studied using oral microbial organs and various look a like methodology are being employed to solve many oral problems from different directions. Human oral microcosm, a simulation system for oral microbial biofilms is an up developing system for biofilm studies in vitro and a good number of researchers all around the world are giving effort on biofilm research in human oral microcosm currently.

We have constructed a human oral microcosm or artificial mouth system, employed to construct biofilms persistently on experimental samples and to study cariology and related biofilms in vitro. Initially, single bacterial species had been used to investigate primary bacterial attachment, colonization and sucrose dependent biofilm growth and detachment. Most recently, we succeeded to construct consortium biofilms in our system. In one of those consortium biofilms three species of oral streptococci, that is streptococci mutans (S mutans), streptococci sobrinus (S sobrinus) and streptococci gordonii (S gordonii) have formed a biofilm that strongly remain attached on experimental samples and couldn’t be removed from the surfaces of the RC blocks by the bubbling effect of Sonicare Elite toothbrush. Interestingly, significant variations were observed while tried to detach or remove the biofims with high power sonication using a homogenizer. Significantly more bacterial cells and glucan could be removed from the 1 mm polished surface of Estenia than that from Gradia. In addition, 1 mm polished Estenia showed most shiny surface after sonication compared to #800 polished surfaces of both materials as observed by naked eye and scanning electron microscope (SEM), very small number of bacterial cells remain attached when measured the turbidity. 

In another experiment, consortium biofilms have shown that S. mutans mutant devoid of the luxS gene (luxSSm) formed an altered biofilm in human microcosm.

 

8.         自己組織化ナノバイオマテリアルの設計とDDSとしての利用

野村 M. 慎一郎

 

I.                    自己組織化材料とは，物質と場の相互作用から構造と機能を生み出すという，生物が当然のように用いている自己組織化原理を材料に応用しようというアプローチです．我々のラボでは現在，これを用いた動的機能性材料に関するテーマが３本進行中です．

II.                  細胞連結装置装備型人工細胞）gap-junctionを形成するコネキシンタンパク質が細胞サイズリポソーム内部で発現後膜に提示される．この構造は細胞との間で機能的なgap-junctionを形成し,相互に物質輸送が可能．表層をリン酸カルシウムで覆った仕様を検討中．II. リン脂質チューブ状膜ネットワーク構造）神経細胞網に似た形態を持つリポソーム変形体のネットワーク．親水性内部空間を持ち，アガロースゲル中で構造が保持され，外部よりの化学的刺激に応答して小サイズリポソームへと変化しゲルより流出する．水溶性・脂溶性・両親媒性物質の徐放に使用可．培養神経細胞との間の相互作用を試験中（共同研究）．III. 外部刺激によって崩壊‐再構成挙動を示すナノゲル構造）内部に複数の疎水性ドメインをもち，不活性タンパク質等を内包可，分子シャペロン活性を示す．表面にＤＮＡ分子を保持した構造を形成可能．がんワクチンとして臨床試験中（共同研究）．

l         課題：I. 膜タンパク質の裏表配向の分布・膜内での分布・単離と小サイズ化（～200nm）手法の確立・上皮・骨細胞への物質移送．II. 薬剤徐放効率の確認．III. タンパク導入担体として細胞との相互作用試験．

l         ～物質輸送のご依頼は少量からでもお受け致しております～

 

9.        プロテインキナーゼWNKの機能解析

森口　徹生

セリン／スレオニンプロテインキナーゼWNK( with no K (lysine) )は線虫から哺乳類まで存在する進化的に保存されたセリン／スレオニンキナーゼであり、線虫には一つ、哺乳類には四つのファミリー分子が存在する。ヒトWNK1およびWNK4は遺伝性高血圧症（偽性低アルドステロン症Ⅱ型と呼ばれるもので、高カリウム血症と高血圧を呈する常染色体優性遺伝性疾患）の原因遺伝子であることが2001年に報告された。また、WNK1ノックアウトマウスは致死であることなどからも、生体内におけるWNKの生物学的な重要性が示唆される。これまでにいくつかのイオンチャネル、トランスポーターの局在制御あるいは活性調節などが報告されているが、未だに未解明な機能が多く残されていると考えられる。今回はWNK結合分子として同定したプロテインキナーゼの制御機構を中心に話をする予定である。