遺伝子診断
・ｃＤＮＡ・ゲノムＤＮＡのクローニング
  • ｃＤＮＡ
１．病気を調べるにタンパク質の異常を調べたい。
２．タンパク質の異常を調べるにはｍＲＮＡを調べればよい。
３．しかし、ｍＲＮＡは不安定なので解析しづらい。
４．そこで、ｍＲＮＡをＤＮＡ（デオキシリボ核酸・安定性が高い）に置換して解析する。

注意；ＤＮＡ：イントロン有り　ｃＤＮＡ：イントロンなし

  • クローニング；１つの核酸分子のコピーを多数作る技術。（プリントNo.3最左図）
    • １つの遺伝子を完璧に解析するのは難しいのでコピーを解析しその結果を総合する。
  • 制限酵素；特定の塩基配列を認識して切断する酵素。

    ＜例＞

  • プラスミド；細菌に寄生する環状ＤＮＡ。（自律的な自己複製機能をもった共生的な染色体外環状２本鎖ＤＮＡ）
  • ＤＮＡリガーゼ；異なるＤＮＡ間を連結する酵素
・ＤＮＡの解析法

  • サザンハイブリダイゼーション法（プリントNo.3中図）余談
    • ハイブリダイゼーション：塩基の相補性を利用して、由来の異なる核酸同士の２本鎖分子を作らせること。
    • プルーブ：塩基の相補性を利用して、目的とする核酸を選択するための短いＤＮＡ。

    サザン氏は解析したいＤＮＡとアイソトープでラベルしたプルーブをハイブリダイズして電気泳動を行った。

  • 注意：ＴＡＡＧＣはプルーブ
・ＰＣＲ法　polymerase chain reaction　　　ＤＮＡ断片の機械的な増殖法・クローニングに代わる技術

用語解説

  • プライマーＤＮＡ：ＤＮＡ合成の時、合成開始点となる短いＤＮＡ
  • アニーリング：１本鎖ずつにＤＮＡが２本鎖にもどること

方法

tube の中に... 鋳型ＤＮＡ：増幅させたいサンプルＤＮＡ
　　　　　　　プライマー：目的とするＤＮＡ領域の開始部分と終了部分の２種
　　　　　　　熱耐性ポリメラーゼ：高熱条件かでも機能を失わない、ＤＮＡ伸長酵素
　　　　　　　ＮＴＰ：ＡＴＰ・ＧＴＰ・ＣＴＰ・ＧＴＰの総称 
以下プリントＮｏ．３参照

を入れ... １）熱変性：90℃1m
　　　　２）アニーリング：50-60℃1m
　　　　３）ＤＮＡ合成：70℃2m

の作業をｎ回繰り返すと目的とする領域のＤＮＡが２ｎ個複製される。（中には目的以外の部分を持つものも含まれる）

利用方法

１）増殖したＤＮＡを... サザン法にかける
　　　　　　　　　　　家系解析に用いる（親子鑑定）
２）ウィルスの検出：ウィルスに感染すると起こる変異の有無を調べる。
３）微量のｍＲＮＡを検出：調べたいｍＲＮＡをｃＤＮＡに置き換えそれをＰＣＲにかけ、増やす。